CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.6. Các hoạt chất đƣợc ứng dụng để tạo phức với 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin
2-HYDROXYPROPYL-β-CYCLODEXTRIN VÀ 2-HYDROXYBUTYL-β-
CYCLODEXTRIN 1.6.1. Rutin
Cơng thức hóa học:
Hình 1.6. Công thức cấu tạo của rutin
Tên khoa học: 3[[6-O-(6-deoxy-α-L-mannopyranosyl)-β-D-glucopyranosyl]oxy]-2-(3',4'- dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-4H-1-benzopyran-4-on [21].
Công thức phân tử: C27H30O16. 3H2O. Phân tử lƣợng: 664,6
Tính chất lý hóa:
Cảm quan: bột kết tinh màu vàng hay vàng hơi lục, khơng mùi hay hơi có mùi đặc trƣng. Để ra ánh sáng có thể màu hơi sẫm lại.
Độ tan: tan trong methanol và trong các dung dịch hydroxyd kiềm, hơi tan trong ethanol, thực tế không tan trong nƣớc và dichloromethan [1], [98].
Nhiệt độ nóng chảy: khoảng 210 oC kèm theo phân hủy.
Rutin là một glucosid chiết suất từ nụ cây hoa hòe (Sophora japonica L), họ đậu
(Fabaceae), hoặc từ nhiều cây khác thuộc các họ thực vật khác nhau [6], phải chứa từ 95,0 đến 101,5% C27H30O16 tính theo chế phẩm khan [1].
Rutin có một mạch đƣờng rutinose gồm một phân tử đƣờng rhamnose nối với một phân tử đƣờng glucose bằng liên kết 1-6 và gắn vào nhân quercetin ở vị trí OH-C-3
Cơng dụng:
Rutin có nhiều cơng dụng: làm bền thành mạch, chữa trĩ, hạ huyết áp, hạ mỡ máu, chống viêm, chống co thắt v.v [59].
Các nghiên cứu để làm tăng độ tan của rutin:
Trên thế giới: điều chế phức rutin với βCD, HPβCD theo tỷ lệ mol 1 : 1 bằng phƣơng
pháp đồng kết tủa [32], [59], [98]
Trong nƣớc: chƣa thấy nghiên cứu về tạo phức với HPβCD đƣợc công bố ở các tài liệu
tra cứu.
Đánh giá phức: dựa vào phân tích X-ray, DSC, NMR (1
H-NMR và ROESY, NOESY) [32], [98], định lƣợng rutin trong phức bằng phƣơng pháp HPLC, quang phổ UV [35], [59], [61].
1.6.2. Itraconazol (itz) Cơng thức hóa học
Hình 1.7. Cơng thức cấu tạo của itraconazol
Tên khoa học: 4-[4-[4-[4-[[(cis-2-(2,4-dichlorophenyl)-2-(1H-1,2,4-triazol-1- ylmethyl)-1,3-dioxolan-4-yl]methoxy]phenyl]piperazin-1-yl]phenyl]-2-[(1RS)-1- methylpropyl]-2,4-dihydro-3H-1,2,4-triazol-3-on [21], [33], [35], [99].
Công thức phân tử: C35H38Cl2N8O4. Phân tử lƣợng: 706.
Tính chất lý hóa:
Cảm quan: bột kết tinh trắng hoặc gần nhƣ trắng.
Nhiệt độ nóng chảy: 166 - 170 oC. Năng suất quay cực: - 0,10 đến + 0,10.
Độ tan trong nƣớc: 1 ng/ml ở pH 7 và 5 µg/ml ở pH 1, tan tự do trong dichlorometan, tan chậm trong tetrahydrofuran, khó tan trong ethanol.
Cơng dụng:
Itz là thuốc kháng nấm phổ rộng thuộc nhóm triazol, có tác dụng tốt đối với một số nấm
nhƣ Aspergillus spp, Coccidioides, Cryptococus, Candida…, nhiễm nấm xâm lấn trong
suy giảm miễn dịch ở ngƣời [2], [55]. Tuy nhiên, do thuộc nhóm II theo hệ thống phân loại sinh dƣợc học, itz là một trong những loại thuốc khơng tan trong nƣớc điển hình. Độ tan kém của itz trong dịch tiêu hóa là nguyên nhân làm cho sinh khả dụng qua đƣờng uống của dƣợc chất này rất khác nhau [63]. Độ tan thấp là thách thức lớn trong việc xây dựng dạng bào chế chứa itz. [83]. Vì vậy, tăng cƣờng độ tan của itz là một công việc quan trọng trong phát triển công thức của thuốc này [15], [41], [92].
Các nghiên cứu để làm tăng độ tan của itz:
Trên thế giới: một số phƣơng pháp bào chế đã đƣợc đánh giá để cải thiện sinh khả dụng
của itz nhƣ phân tán rắn trong polyme, sử dụng công nghệ kỹ thuật hạt [45], [94].
Các kỹ thuật tinh thể và phƣơng pháp hình thành muối với acid nhƣ acid malonic, acid hydrochloric, đƣợc sử dụng để nâng cao độ hòa tan itz so với các dạng hịa tan vơ định hình [15], [92].
Tạo phức với HPβCD: tỷ lệ mol giữa itz và HPβCD thƣờng là 1 : 1; 1 : 2 và 1 : 3 với các phƣơng pháp tạo phức khác nhau nhƣ đồng bay hơi dung môi, đồng kết tủa, đồng dung mơi, siêu tới hạn… trong đó phƣơng pháp tạo muối với HCl kết hợp tạo phức với HPβCD có hiệu quả tăng độ tan cao và ổn định. Phức itz-HPβCD ức chế tạo mầm kết tinh itz nên ít độc và chứng minh sinh khả dụng tăng cao hơn các phƣơng pháp khác [41], [45], [53], [64], [108].
Trong nƣớc: nghiên cứu làm tăng độ tan của itz dƣới dạng phân tán rắn với PEG 4000,
PEG 6000 cho độ hòa tan thấp, với tỷ lệ itz : eudragit E 100 là 1 : 19 cho độ hòa tan 45% sau 90 phút.
Tạo hệ phân tán rắn với HPβCD bằng phƣơng pháp đồng dung môi theo tỷ lệ giữa itz và HPβCD là 1 : 7 cho độ hòa tan gần 63% sau 15 phút và tỷ lệ 1 : 10 độ hòa tan đạt gần 90% trong 10 phút đầu. Bằng phƣơng pháp phun sấy với tỷ lệ itz : HPβCD là 1 : 5 và 1 : 7 cho độ hòa tan của itz đạt gần 100% sau 5 phút. Với các tỷ lệ này rất khó ứng dụng vào các dạng thuốc vì khối lƣợng tăng lên quá cao [3].
Đánh giá phức itz-HPβCD: dựa vào phân tích IR, DSC, X-ray [41], [83], [108], NMR
(1H-NMR và ROESY, NOESY) [33], [53]. Định lƣợng itz trong phức bằng phƣơng pháp HPLC [45], [83], quang phổ UV trong HCl 0,1 N [41], [45], [53], [63], [64], [92].
1.6.3. Meloxicam (ME) Cơng thức hóa học:
Hình 1.8. Cơng thức cấu tạo của meloxicam
Tên khoa học: 4-hydroxy-2-methyl-N-(5-methyl-2-thiazolyl)-2H-1,2-benzothiazin-3- carboxamid 1,1-dioxid [13], [21], [99].
Công thức phân tử : C14H13N3O4S2. Phân tử lƣợng: 351,4
Tính chất lý hóa:
Cảm quan: bột màu vàng nhạt.
Nhiệt độ nóng chảy 254 oC. pKa = 4,08 (trong nƣớc)
Độ tan: thực tế khơng tan trong nƣớc, ít tan trong ethanol, tan trong dimethylformamid [21]
Công dụng:
ME là thuốc kháng viêm không steroid (NSAIDs), ức chế chọn lọc COX-2, có tác dụng kháng viêm mạnh [2]. Trong những năm gần đây, ME đã đƣợc lựa chọn để phát triển cơng thức thuốc mới vì nó thể hiện một hiệu quả cao trong các thử nghiệm chống viêm khớp tiềm năng [60]. Tuy nhiên, meloxicam rất ít tan trong nƣớc [22], làm tăng thời gian tiếp xúc với niêm mạc đƣờng tiêu hóa do đó làm tăng tác dụng phụ, đặc biệt khi bệnh nhân phải dùng thuốc lâu dài [8], [52], [77].
Các nghiên cứu về meloxicam: Trên thế giới:
Cấu trúc phân tử: ME tồn tại ở 3 dạng: cation, anion và dạng trung hòa đã đƣợc nghiên cứu kỹ lƣỡng bằng phổ 1H và 13C-NMR [75], [107].
Các nghiên cứu để làm tăng độ tan: tạo phức với HPβCD theo tỷ lệ mol 1 : 1 và 1 : 2 với phƣơng pháp tạo phức trộn khô vật lý, nghiền ƣớt và đồng bay hơi [22], [82].
Trong nƣớc: chƣa thấy công bố ở các tài liệu tra cứu.
Đánh giá phức ME-HPβCD: bằng DSC, X-ray, SEM, IR, 1H-NMR [22], [82], [107], định lƣợng ME trong phức bằng phƣơng pháp quang phổ UV [13], [22], [82].
CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƢỢNG, HĨA CHẤT, DUNG MƠI, NGUN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
- 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin, 2-hydroxybutyl-β-cyclodextrin.
- Phức giữa rutin, itraconazol với 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin, 2-hydroxybutyl-β- cyclodextrin và phức giữa meloxicam với 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin.
2.1.2. Hóa chất, dung mơi, ngun liệu, máy, thiết bị dùng cho tổng hợp, điều chế Bảng 2.1. Danh mục nguyên liệu và hóa chất dùng cho tổng hợp Bảng 2.1. Danh mục nguyên liệu và hóa chất dùng cho tổng hợp
Tên hóa chất Tiêu chuẩn Độ tinh khiết (%) Nguồn gốc Beta cyclodextrin Eur. Ph/USP 98,00 Roquette (Pháp) 1,2-propylen oxid TCNSX 99,90 Merck (Đức)
1,2-butylen oxid TCNSX 99,90 Merck (Đức)
NaOH TCNSX 96,00 Trung Quốc
Nƣớc cất TCNSX 100 Việt Nam
HCl TCNSX 37,00 Trung Quốc
Ethanol TCNSX 99,50 Việt Nam
Aceton TCNSX 99,50 Đài Loan
Bảng 2.2. Danh mục nguyên liệu dùng cho điều chế phức
Tên hóa chất Tiêu chuẩn Độ tinh khiết (%) Nguồn gốc
Rutin DĐVN IV 98,50 Việt Nam
Itraconazol Eur. Ph/BP 99,83 SIMS (Italia)
Bảng 2.3. Danh mục hóa chất dùng cho phân tích, kiểm nghiệm
Tên hóa chất Tiêu chuẩn Độ tinh khiết (%) Nguồn gốc
HPβCD thƣơng mại Eur. Ph/USP - Roquette (Pháp)
Rutin chuẩn Sử dụng trong phân tích 94,00 Sigma
Itraconazol chuẩn Sử dụng trong phân tích 99,90 U.S. Pharmacopeia Meloxicam chuẩn Sử dụng trong phân tích 99,50 Viện Kiểm nghiệm
thuốc TP. HCM Nƣớc amoniac Sử dụng trong phân tích 25 Trung Quốc Isopropanol Sử dụng trong phân tích 99,70 Trung Quốc Acid acetic băng Sử dụng trong phân tích 99,50 Trung Quốc
Bảng 2.4. Danh mục máy, thiết bị
Tên thiết bị Mã số Nguồn gốc
Cân phân tích Sartorius CPA224S Đức
Máy khuấy từ có điều nhiệt Stuart CB162 Anh
Máy khuấy cánh quạt Heidolph- RZR Đức
Máy đo pH CyberScan 510 Mỹ
Máy cô quay
Máy phân tích nhiệt vi sai
Büchi R210S
Mettler Toledo STARe SW
Thụy Sĩ Thụy Sĩ Máy đo điểm chảy Gallenkamp MPD 350. BM 3.5 Anh Máy quang phổ UV-Vis Shimadzu UV-1800 Nhật Máy quang phổ hồng ngoại Shimadzu FTIR-8201PC Nhật Máy cộng hƣởng từ hạt nhân Bruker AC 500 Đức Máy phổ khối Quatro Micro Api – Micromass Anh Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu LC-20AD Nhật
Máy thử độ hòa tan Erweka DT-700 Đức
Máy lắc rung Tủ sấy chân không
Jeiotech SI600
Jeiotech OV-12/TRP-6
Hàn Quốc Hàn Quốc
2.1.3. Tối ƣu hóa qui trình tổng hợp và xử lý thống kê với sự trợ giúp của phần mềm: mềm:
- Phần mềm JMP 4.0 - SAS Institute Inc.: tối ƣu hóa các yếu tố của qui trình tổng hợp ảnh hƣởng đến hiệu suất và DS của sản phẩm.
- Phần mềm Excel 2003: phân tích thống kê dữ liệu.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. TỔNG HỢP 2-HYDROXYPROPYL-β-CYCLODEXTRIN (HPβCD) 2.2.1.1. Qui trình tổng hợp 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin 2.2.1.1. Qui trình tổng hợp 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin
Sơ đồ qui trình tổng hợp 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin (xem sơ đồ 2.1 trang 34) Các bƣớc tiến hành nhƣ sau:
Bước 1. Điều chế 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin:
Mức khởi đầu: hòa tan 1,5 g NaOH (0,0375 mol) trong 100 ml nƣớc cất trong bình cầu 250 ml, thêm 5,79 g βCD (5 mmol, 98%), dung dịch đƣợc khuấy hồi lƣu trong 1,5 giờ. 2,83 ml 1,2-propylen oxid (2,35 g 99%, 40 mmol) đƣợc thêm vào từng lƣợng nhỏ trong 1 giờ. Sau đó dung dịch đƣợc khuấy hồi lƣu ở nhiệt độ phòng cho đến khi phản ứng kết thúc. Theo dõi bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (TLC):
Điều kiện sắc ký: bản mỏng silicagel GF254
Hệ dung môi khai triển: isopropanol - ethylacetat - nƣớc (5 : 2 : 2) (tt : tt : tt)
Bản mỏng thứ nhất: chấm vết thứ nhất 10 µl dung dịch βCD 0,5% trong nƣớc, vết thứ 2 10 µl dung dịch phản ứng.
Bản mỏng thứ 2: chấm 1 vết thứ nhất 10 µl dung dịch phản ứng, vết thứ 2 10 µl dung dịch HPβCD đối chiếu nồng độ 0,5% trong nƣớc.
Phát hiện: dùng hơi iod bão hòa.
Chỉ tiêu đánh giá: trên sắc ký đồ của bản mỏng thứ nhất khơng cịn phát hiện vết βCD trong dung dịch phản ứng, bản mỏng thứ 2: vết sản phẩm tạo thành khơng cịn kéo đi và có Rf tƣơng đƣơng với HPβCD đối chiếu.
Bước 2. Tinh chế sản phẩm: sau khi kết thúc phản ứng, dung dịch acid HCl 1 M đƣợc
thêm vào để trung hòa hỗn hợp phản ứng và điều chỉnh đến pH trung tính. Cơ loại nƣớc ở 80 oC dƣới áp suất giảm đến khi dịch sánh nhƣ siro, cho ethanol 99,5% với lƣợng vừa đủ để hòa tan sản phẩm, khuấy khoảng 30 phút, muối NaCl không tan trong ethanol sẽ kết
tủa, lọc loại muối. Thêm aceton vào dịch lọc khuấy trong 30 phút ở nhiệt độ 0 - 5 oC đến khi sản phẩm tủa hồn tồn. Lọc lấy tủa, hịa trong lƣợng tối thiểu ethanol 99,5% và thêm aceton lặp lại nhiều lần đến khi tủa tạo bột tơi. Sấy khô ở 80 oC dƣới áp suất giảm đến độ ẩm qui định.
Bước 3. Đóng gói và dán nhãn: đóng gói trong túi polyethylen hàn kín, dán nhãn bảo
quản ở nhiệt độ phịng.
Sơ đồ 2.1. Qui trình tổng hợp 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin
NaCl
Cô dung dịch phản ứng
(Dƣới áp suất giảm, nhiệt độ 80 o
C)
Điều chế dung dịch βCD/NaOH
(Khuấy hồi lƣu: vận tốc, nhiệt độ, thời gian)
Aceton 1,2-propylen oxid HCl 1 M Ethanol 99,5% Đóng gói thành phẩm Thu sản phẩm
(Sấy khô dƣới áp suất giảm, nhiệt độ 80o
C)
Kiểm nghiệm
Beta cyclodextrin
Thu lấy sản phẩm thô (tủa)
(Khuấy 30 phút, nhiệt độ 0 - 5 oC, lọc)
Aceton
Lọc lấy dung dịch chứa HPβCD
(Khuấy 30 phút)
NaOH + H2O
Phản ứng tổng hợp HPβCD
Khuấy hồi lƣu: vận tốc (x1), nhiệt độ (x2), thời gian (x3)
Thăm dò ảnh hƣởng của nồng độ NaOH đến hiệu suất và DS của phản ứng: xác định
ở 4 mức nồng độ NaOH: 1%, 1,5%, 1,75% và 2%. Các thành phần khác tham gia phản ứng giữ nguyên nhƣ mức khởi đầu. Ở mỗi nồng độ NaOH tiến hành 3 phản ứng. Từ kết quả thu đƣợc, xác định nồng độ NaOH phù hợp cho phản ứng tổng hợp.
Hiệu suất của phản ứng (x%): đƣợc tính bằng cách cân trực tiếp sản phẩm sau khi đã
tinh chế và kiểm tra độ tinh khiết, sấy đến độ ẩm qui định (< 5%) theo công thức:
( )
( ) ( )
m: khối lƣợng (g) của sản phẩm tổng hợp đã tinh chế. n: số mol βCD tham gia phản ứng
MβCD: phân tử gam của βCD
DS: độ thế của sản phẩm HPβCD tổng hợp tính từ phổ 1
H-NMR đo trong D2O M1,2-propylen oxid: phân tử gam của 1,2-propylen oxid.
2.2.1.2. Xác định cấu trúc của HPβCD tổng hợp
Lấy sản phẩm của phản ứng ở mức khởi đầu sau khi đã tinh chế đạt độ tinh khiết để đo phổ IR, 1H và 13C-NMR, phổ MS:
Phổ IR: áp dụng kỹ thuật viên KBr.
Chuẩn bị mẫu thử: nghiền 1 - 2 mg chất thử với 100 - 200 mg bột mịn KBr (dùng cho IR) đã đƣợc sấy khô, đủ để tạo thành 1 viên nén có đƣờng kính 13 mm và cho phổ có cƣờng độ phù hợp. Hỗn hợp đƣợc nghiền cẩn thận và rải đều trên 1 khn thích hợp. Nén khn có hỗn hợp chất thử tới áp suất khoảng 800 Mpa trong điều kiện chân không.
Tiến hành đo phổ: phổ IR của mẫu thử phải có các đỉnh hấp thụ đặc trƣng của các nhóm chức: O-H, C-H, C-O và phù hợp với phổ IR của mẫu HPCD đối chiếu.
Phổ NMR: đo phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC trong dung môi
D2O trên máy NMR Bruker AC 500 MHz: xác định tƣơng tác H→H, H→C và cấu trúc của sản phẩm tổng hợp.
Phổ khối (MS): đo trong methanol ở khoảng từ 0 - 2000 m/z trên máy đo phổ khối bằng
kỹ thuật ESI (electrospray ionization): xác định sự phân bố các phân tử HPβCD có các DS khác nhau trong sản phẩm tổng hợp.
2.2.1.3. Xác định các yếu tố của phản ứng ảnh hƣởng đến hiệu suất và DS của sản phẩm tổng hợp
Các yếu tố của phản ứng tổng hợp ảnh hƣởng đến hiệu suất và DS của sản phẩm đƣợc chọn khảo sát gồm: vận tốc khuấy, nhiệt độ, thời gian của phản ứng.
- Vận tốc khuấy (x1) chọn khoảng thăm dò từ 400 - 1200 vòng/phút với Δv = ± 200 vòng/phút.
- Nhiệt độ của phản ứng (x2) chọn khoảng thăm dò từ 20 - 45 oC với Δto = ± 5 oC - Thời gian phản ứng (x3) chọn khoảng thăm dò từ 14 - 28 giờ với Δt = ± 2 giờ.
2.2.1.4. Tối ƣu hóa các yếu tố của qui trình tổng hợp ảnh hƣởng đến hiệu suất và DS của sản phẩm
Ứng dụng phần mềm JMP 4.0 với mơ hình Box-Behnken để thiết kế thực nghiệm theo kiểu bề mặt đáp ứng (responce surface design DOE)
Các yếu tố cố định: 5 mmol βCD, 40 mmol 1,2-propylen oxid, 100 ml H2O, 0,0375 mol NaOH.
Các yếu tố biến thiên khảo sát: từ các phản ứng thăm dị tìm ra khoảng biến thiên và mã
hóa các yếu tố: vận tốc khuấy (x1), nhiệt độ (x2), thời gian (x3).
Tiến hành 15 phản ứng trong đó có 3 phản ứng lặp lại ở tâm gồm các yếu tố độc lập: x1, x2, x3. Hai yếu tố phụ thuộc đƣa vào khảo sát là hiệu suất (y1) và DS (y2) của phản ứng. Chỉ tiêu đánh giá: y1 và y2 cao nhất và có độ lặp lại.
Hình 2.1. Bố trí thí nghiệm kiểu thiết kế bề mặt đáp ứng (DOE)
DS tính từ kết quả đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H-NMR) của HPβCD trong D2O Tính các thơng số tối ƣu dựa vào phƣơng trình:
Hoặc sử dụng phần mềm Box-Behnken.
Xác định hệ số tƣơng quan và ảnh hƣởng của các yếu tố đến hiệu suất và DS của sản phẩm tổng hợp từ kết quả của phần mềm Box-Behnken.
Từ kết quả phần mềm dự báo, tiến hành 3 phản ứng tổng hợp ở điều kiện tối ƣu để kiểm tra lại.
2.2.1.5. Tổng hợp HPβCD có các DS khác nhau
Tiến hành phản ứng ở điều kiện tối ƣu với sự thay đổi tỷ lệ mol βCD : 1,2-propylen oxid. Các yếu tố cố định: 5 mmol βCD, 100 ml H2O, 0,0375 mol NaOH.
Yếu tố thay đổi: 1,2-propylen oxid tăng từ 30 - 60 mmol với Δ = 5 mmol đến khi sản