Phổ 13C, DEPT (90, 135), tần số đo 125 MHz. Phổ 1H, COSY, HSQC, HMBC tần số đo 500 MHz. T = 302 K. Vị trí Nhóm cấu trúc δ13C ppm δ1H ppm J(Hz) Độ bội (ppm) COSY HH HMBC HC 1 101,76 5,155 vạch tù 2,1 2,3,4 11 99,32 5,296 vạch tù 12 100,53 5,317 vạch tù 2 72,13 3,723 vạch tù Vùng các vạch chéo tƣơng quan chập không xác định đƣợc 2',3,4,1 21,22 71,58 3,723 vạch tù 3 73,15 4,033 vạch tù 2,5,4 31,32 72,96 4,014 vạch tù 4 80,96 3,665 vạch tù 1,2,3,5,6 41,42 79,89 3,682 vạch tù 5,51,52 71,88 3,935 chồng lấp với 6 3,4 6,61,62 60,41 3,957 chồng lấp với 5 và 3 5,4 1'1,2 (a*) 76,93 3,810 chồng lấp với 2 và 5 1,2' 2',2,1 1'1,2 (b*) 76,27 3,607 chồng lấp với 4 1,2' 2'1 66,78 4,100 chồng lấp với 2'2 3',1' 1' 2'2 66,34 4,087 chồng lấp với 2'1 3',1' 3'1 18,42 1,113 không tách vạch 2' 2,1 3'2 18,08 2'
Phân tích dữ liệu phổ NMR: trên cơ sở thông tin ban đầu từ βCD, việc phân tích phổ
HPβCD tổng hợp cũng đƣợc xuất phát từ phổ 13C.
Nguyên tắc chung của sự thế này là C-1 ở đầu cầu của phân tử 1,2-propylen oxid sẽ tƣơng
tác với 2 nhóm OH là OH-C-2, OH-C-3 của βCD để hình thành liên kết -C(2)-O-R (R = -CH2-CHOH-CH3), -C(3)-O-R ở nồng độ kiềm thấp và nhóm OH-C-6 để hình thành
liên kết -C(6)-O-R ở nồng độ kiềm cao.
Tuy nhiên, theo Hong Yuan Sun và cộng sự [43], [49] đã nghiên cứu, sự thế OH-C-6 (là alcol bậc nhất) rất khó khăn, cần có những điều kiện đặc biệt. Vì vậy trong quá trình thế đã đƣợc thực hiện ở môi trƣờng kiềm thấp ở đây sản phẩm thu đƣợc chỉ bao gồm sự thế vào vị trí OH ở C-2 và C-3 của từng mắt xích trong 7 mắt xích glucopyranose hồn tồn đồng nhất của βCD.
Vì q trình thế xảy ra bất kỳ ở mắt xích nào, do đó trong q trình thế có thể có mắt xích bị thế 1 lần, có mắt xích bị thế 2 lần, có mắt xích chƣa bị thế, trừ khi cả 7 mắt xích đều bị thế 2 lần (hiệu suất thế 100%).
Vì vậy tín hiệu cộng hƣởng từ 1
H hay 13C của HPβCD, ví dụ 13
C-1 hay 1H-1 sẽ tách thành 3 vạch: 1 vạch tƣơng ứng với mắt xích khơng bị thế ký hiệu là 1 (chƣa thế), 1 vạch ký hiệu là 11 (thế 1 lần), 1 vạch ký hiệu là 12 (thế 2 lần). Sự tách thành 3 vạch về nguyên lý, xảy ra cho mọi tín hiệu 1
H hay 13C. Tuy nhiên sự giãn phổ có thể gây lên sự chồng chập do vạch phổ bị mở rộng, đặc biệt là phổ 1H. Thí dụ H-5 và H-6 của βCD chƣa thế cũng đã bị chồng chập.
Về gốc thế vì khơng có dạng ngun nên trong quá trình thế chỉ xuất hiện sự tách thành 2 vạch, thí dụ 1'1 và 1'2. Đó là ngun tắc của q trình đánh số đƣợc ghi trong bảng dữ liệu phổ.
Theo qui ƣớc đánh số trên, xuất phát từ phổ 13C, kết quả phân tích phổ đƣợc trình bày ở cột δ13C ppm.
Từ giá trị δ13C ppm, bằng phổ HSQC xác định tiếp giá trị δ1H ppm. Phổ COSY và HMBC cung cấp thêm sự khẳng định kết quả.
Điều khó khăn ở đây là vùng phổ 1H, trừ vị trí H-1 của βCD và CH3-(3') của HPβCD, phần còn lại đều bị giãn vạch và chồng chập. Sự chồng chập này càng tăng mạnh vì nhóm
-CH2- (1') chứa 2 proton khơng tƣơng đƣơng đƣợc chỉ ra rất rõ ở phổ HSQC. Nếu ở phổ βCD cụm tín hiệu H-2 và H-4 tách rời hẳn khỏi cụm tín hiệu của H-5 và H-6 thì ở HPβCD 2 tín hiệu H-1'(a) và H-1'(b) lại chèn vào giữa 2 cụm tín hiệu khiến cho, trừ 2 tín hiệu H-1 và H-3(3'), tất cả các tín hiệu proton cịn lại đều chen phủ.
Tuy nhiên sự nhận diện xuất phát từ phổ 13C (13C & DEPT 90, DEPT 135) và phổ tƣơng quan 2D-HSQC cũng đã giúp cho việc xây dựng bảng số liệu đƣa ra trên đây là đủ độ tin cậy để từ đó làm cơ sở so sánh và khẳng định hợp chất HPβCD tổng hợp đƣợc là chính xác.
Phân tích tồn bộ hệ thống dữ liệu của HPβCD tổng hợp so với HPβCD thƣơng mại có thể thấy rõ đây là 2 mẫu hoàn toàn đồng nhất về cấu trúc, biến động về các giá trị δ1
H và δ13C đều khơng đáng kể, chấp nhận đƣợc vì 2 mẫu này có DS khác nhau.
Nhìn chung phổ HPβCD thƣơng mại có độ phân giải tốt hơn phổ của HPβCD tổng hợp (tuy khơng đáng kể). Lý do có thể do mẫu HPβCD thƣơng mại đo ở 297 K còn HPβCD tổng hợp đo ở 302 K. Nhiệt độ làm tăng độ dao động phân tử mạnh hơn vì vậy độ phân giải phổ có thể bị ảnh hƣởng. Ở đây sự chênh lệch nhiệt độ là 5 K là khoảng chênh lệch đủ nhận ra sự khác biệt.
Có một chi tiết khác biệt có thể có ý nghĩa là ở vị trí -CH2-1' khi thế vào vị trí OH-C-2 (hoặc OH-C-3) của βCD sẽ có sự phân biệt độ dịch chuyển hóa học của H-1'a và H-1'b, 2 proton của nhóm -CH2-1' khơng cịn tƣơng đƣơng. Ở phổ HPβCD tổng hợp sự phân biệt này không rõ nhƣng ở phổ HPβCD thƣơng mại sự phân biệt này lại rõ hơn. Có thể do HPβCD thƣơng mại có DS thấp hơn, các nhóm thế gây che chắn khơng gian vì vậy cũng ít hơn nên độ phân giải tốt hơn. Vì vị trí này nằm ở vùng chèn lấp với H-4 và H-2 của βCD nên không thể xác định đƣợc hằng số tƣơng tác và do vậy không thể đƣa ra đƣợc một nhận xét có cơ sở khoa học.
Từ các dữ liệu phân tích phổ NMR có thể kết luận HPβCD tổng hợp đƣợc qui mô cỡ kg trong phịng thí nghiệm có cấu trúc hồn tồn đúng và độ sạch khơng thua kém HPβCD thƣơng mại vì ở phổ NMR đƣờng nền phổ rất tốt, khơng xuất hiện vết tạp nào trừ tín hiệu dung mơi D2O ở δD = 4,705 ppm.
Các chỉ số kỹ thuật liên quan rút ra từ phổ NMR: (dữ liệu phổ 1
H-NMR từ phụ lục 4 hình PL.4.2)
Mức độ thế: trong phổ 1H-NMR, 1 đơn vị cƣờng độ tín hiệu trên phổ tỷ lệ bậc nhất với nồng độ (cũng là số lƣợng) của proton tạo tín hiệu đó. Thí dụ trong cùng 1 nhóm chức -CH2-CHOH-CH3 thì cƣờng độ của tín hiệu -CH2- nếu đƣợc chọn là 2 đơn vị thì cƣờng độ của tín hiệu -CH3 phải là 3 đơn vị.
Nhƣ vậy 1 phân tử (1 mắt xích) glucopyranose nếu đã đƣợc thế ở OH-C-2 chẳng hạn, bằng 1 phân tử 2-hydroxypropyl thì tín hiệu CH3 của nhóm thế sẽ có cƣờng độ lớn gấp 3 lần so với cƣờng độ của tín hiệu H-1 glycosidic của 1 mắt xích glucopyranose trong βCD. Nếu sự thế với 1 mắt xích là hồn tồn triệt để thì tỷ lệ giữa 1/3 cƣờng độ của nhóm -CH3-(3') của 2-hydroxypropyl chia cho cƣờng độ của tín hiệu H-1 của 1 mắt xích
glucopyranose phải bằng 1. Từ đó mức độ thế (ms) đƣợc tính theo công thức: với A1 là cƣờng độ của tín hiệu -CH3-(3'). A2 là cƣờng độ của tín hiệu H-1
Độ thế: đƣợc định nghĩa là: DS = 7 x ms. Những qui ƣớc này xuất phát từ sản phẩm chỉ
thế 1 lần là 2-O-(2-hydroxypropyl)-β-cyclodextrin. Với sản phẩm này, nếu sự thế xảy ra hồn tồn thì ms = 1 và DS = 7. Tuy nhiên trong sản phẩm đã thu đƣợc, sự thế không chỉ xảy ra ở vị trí 2 mà cịn xảy ra ở vị trí 3. Điều này thể hiện rất rõ ở bảng 4.2 và bảng 4.3. Ở phổ NMR của HPβCD, tín hiệu đặc biệt rõ là ở phổ 13C của các carbon và hydro ở vị trí 1 đều tách 3 điều đó chứng tỏ βCD đã đƣợc thế 1 hay 2 lần và vẫn cịn mắt xích chƣa bị thế. Các tín hiệu 1H và 13C của 2-hydroxypropyl cũng tồn tại ở mỗi tín hiệu sự tách đôi ứng với 2-O-(2-hydroxypropyl) và 3-O-(2-hydroxypropyl). Riêng tín hiệu -CH3-3' của 2-hydroxypropyl do khoảng cách xa với vị trí thế (4 liên kết σ) nên có khi khơng thể hiện sự tách đơi.
Từ đó để tính mức độ thay thế phân tử (ms) và độ thế (DS) đều lấy tổng cƣờng độ H-1 không bị thế, H-11 (thế 1 lần), và H-12 (thế 2 lần), với tín hiệu -CH3-3'sẽ lấy tổng cƣờng độ -CH3-3'1 và -CH3-3'2. Trong trƣờng hợp HPβCD tổng hợp bảng dữ liệu đã chỉ rõ tín hiệu δ13C tách vạch nhƣng tín hiệu δ1H lại chập 3'-1 và 3'-2 (khơng thể sử dụng tín hiệu của 13C đƣợc vì tín hiệu 13C khơng có cƣờng độ tỷ lệ với nồng độ).
Kết quả tính cụ thể là:
( )
Hiệu suất thế: có thể tính hiệu suất thế (%), điều này hay đƣợc sử dụng trong hóa học.
Thí dụ từ tín hiệu của H-1. Do bị thế H-1 tách thành 3 vạch: H-1, H-11 và H-12 với H-1 là phần chƣa bị thế, H-11 là phần bị thế 1 lần, H-12 là phần bị thế 2 lần.
Nhƣ vậy nếu gọi I(1) là cƣờng độ của vạch chƣa thế I(H1), I(11) là cƣờng độ của vạch H-11 và I(12) là cƣờng độ của vạch H-12 thì hiệu suất thế tổng quát P là:
( ) ( )
( ) ( ) ( )
Nếu sự tách vạch là triệt để có thể tính P1 (hiệu suất thế 1 lần) và P2 (hiệu suất thế 2 lần). Tuy nhiên ở phổ 1H-NMR hầu nhƣ khơng có sự tách dành mạch của H-11 và H-12 nên chỉ tính tổng P:
Đây là một hiệu suất thế không nhỏ đối với sản phẩm HPβCD tổng hợp.
So sánh các chỉ số kỹ thuật của HPβCD tổng hợp và HPβCD thƣơng mại Bảng 4.4. So sánh các chỉ số kỹ thuật của HPβCD tổng hợp và HPβCD thƣơng mại
Chỉ số HPβCD tổng hợp HPβCD thƣơng mại Mức độ thế (ms) 0,772 ( ) Độ thế (DS) 5,404 Hiệu suất thế (P) 44,86%
(Số liệu tính ms, DS, P lấy từ kết quả đo phổ 1
H-NMR phụ lục 3 hình PL. 3.2 và phụ lục 4 hình PL. 4.2)
Nhƣ vậy cả 3 chỉ số của HPβCD tổng hợp đƣợc đều cao hơn HPβCD thƣơng mại. Đây là một kết quả tốt đối với chất lƣợng sản phẩm thu đƣợc.
Tính tổng số proton
Về ngun tắc có thể tính tổng số proton theo tổng đơn vị cƣờng độ nhƣ 1 số tài liệu đã đề cập [43], [50], [73]. Tuy nhiên do sự chồng pic, đƣờng nền trở nên khơng chuẩn vì thế cƣờng độ đƣợc ghi cho vùng này thiếu chính xác. Trong nhiều trƣờng hợp có vùng cịn chèn với tín hiệu dung mơi do đó khơng thể tính đƣợc.
4.1.3. Phổ khối: kỹ thuật bắn phá: ES+
(electrospray ionization)
Một số ngun tắc chung:
Tính số khối: cơng thức phân tử của βCD: C6H10O5. Khối lƣợng phân tử: 1134,994 Cơng thức phân tử của nhóm thế: -CH2-CHOH-CH3. Khối lƣợng phân tử: 59,08
Ở lần thế thứ nhất, nhóm OH ở C-2 của βCD tƣơng tác với C-1′ của 1,2-propylen oxid tạo liên kết -C-O-CH2-. Nhƣ vậy, về số khối có thể tính là phân tử βCD mất 1H còn 1,2-propylen oxid thêm 1H.
Từ đó ở lần thế thứ nhất, số khối của phần βCD tham gia tạo HPβCD thế 1 lần là 1134,994 -1 = 1133,994 đvc còn phần của 1,2-propylen oxid tham gia tạo HPβCD thế 1 lần là 58,08 + 1 = 59,08. Vậy số khối của phân tử HPβCD thế 1 lần sẽ là:
MHPβCD(1) = 1133,994 + 59,08 = 1193,074.
Từ lần thế thứ 2, khung HPβCD (1) cứ mỗi lần thế sẽ mất thêm 1H của nhóm OH ở vị trí thế, nhƣ vậy HPβCD thế 2 lần sẽ có số khối là:
MHPβCD(2) = MHPβCD(1) – 1 + 59,08 = MHPβCD(1) + 58,08
Mở rộng kết quả trên, từ lần thế thứ 2 công thức chung để tính số khối (khối lƣợng phân tử) của HPβCD thế n lần sẽ là:
MHPβCD(n) = [MHPβCD(1) + (n-1) x 58,08] đvc. (a) n: số lần thế
Q trình ion hóa tạo pic phổ khối
Trong phổ khối, các pic phổ luôn đƣợc ghi nhận dƣới dạng ion. Ở kỹ thuật ES+, tác nhân tạo ion thƣờng gặp là H+, Na+, K+ …Tùy đặc thù của lớp khí mang và qui trình đƣợc sử dụng khi ghi phổ ion phá mảnh sẽ là 1 ion cụ thể trong các ion trên. Thƣờng gặp nhất ở phƣơng pháp ES+
Để tạo mảnh, ion tác nhân phải phá vỡ 1 liên kết nào đó của phân tử đƣợc nghiên cứu để phân tử trở thành 1 ion. Trong trƣờng hợp HPβCD đang nghiên cứu, với phổ khối, ion có số khối lớn nhất ứng với phân tử đƣợc thế nhiều lần nhất sẽ bị ion hóa. Phân tử này sẽ bị phá vỡ 1 liên kết nào đó. Từ đó 2 đầu liên kết bị cắt, 1 đầu có thể kết hợp với hydro cịn 1 đầu sẽ kết hợp với Na+ tạo thành ion phân tử (*).
Nhƣ vậy, từ 1 phân tử trung hịa có khối lƣợng phân tử là M sau khi phá mảnh tạo thành ion sẽ là:
M'+m/z = M + mNa = M + 23 (M'+ = M vì z = 1) M'+m/z = M + mH + mNa = M + 1 + 23
Vì quá trình này chỉ xảy ra 1 lần nên có thể chỉ cần tính ở 1 mảnh bất kỳ trong các mảnh
đƣợc ghi trên phổ khối, các mảnh khác đều chỉ khác ở phần thế đã xảy ra về số khối [(n - 1) x 58,08 ứng với HPβCD].
Nhƣ vậy, vì khơng xác định đƣợc pic phân tử có số khối lớn nhất (thế nhiều lần nhất), vì mất pic do cƣờng độ pic quá nhỏ (vùng có số khối >1681,05), có thể xác định số khối của ion M+(1) (thế 1 lần) làm xuất phát điểm:
M'+m/z(1) = M + mNa = MHPβCD(1) + 23 = 1193,074 + 23 = 1216,074 Trong phổ khối ghi đƣợc mảnh này cũng nhƣ các mảnh tiếp theo.
Trong phổ đồ cịn có các pic có số khối tƣơng ứng với [mH + MNa]+ hoặc là các đồng vị của carbon hoặc hydro tạo ra trong q trình ion hóa.
Sự khác biệt của HPβCD là ở chỗ trong phổ MS của nó tồn tại mảnh vỡ của βCD khơng chứa nhóm thế tƣơng ứng với pic có số khối 1158,27 đvc. Để tạo ion, ngồi cơ chế tấn cơng của Na+, vịng βCD đã nhận thêm Na+, có thể phân tử βCD khơng nhận thêm 1H mà đứt liên kết -O-C(1)-O-C(4)- để thành -O-C(1)-OH và -CH-… Nhƣ vậy số khối của ion này sẽ là:
Phân tích phổ khối lƣợng của HPβCD tổng hợp (phụ lục 4, hình PL.4.8)
Bảng 4.5. Phổ khối của HPβCD tổng hợp vùng từ 1000 đến 2000 m/z (tính theo cơng
thức (a) mục 4.1.3). Mn
Khối lƣợng dự đoán
Khối lƣợng trên phổ đồ
[MNa]+ [MNa]+ [mH + MNa]+ và đồng vị M1 1216,074 1216,26 M2 1274,154 1274,32 1274,91 M3 1332,234 1332,44 1333,44 M4 1390,314 1390,56 1391,23 M5 1448,394 1448,55 1449,29; 1449,62 M6 1506,474 1506,74 1507,48 M7 1564,554 1564,80 M8 1622,634 1622,73 M9 1680,714 1681,05
(*) cơ chế tạo ion thƣờng rất phức tạp. Để khẳng định thƣờng phải thay đổi thông số đầu vào để lặp lại 1 số lần phép đo kiểm định. Cơ chế + Ho
, + Na+ nhắc tới ở đây chỉ là dự đốn vì phù hợp với kết quả phân tích cụ thể.
Từ kết quả phân tích phổ MS đƣa ra trên đây có thể kết luận:
Quá trình tổng hợp HPβCD từ βCD và 1,2-propylen oxid là thành công. Phổ khối đã khẳng định chất thu đƣợc là HPβCD với công thức phân tử đúng nhƣ dự kiến.
Phổ khối đã chứng minh sự tồn tại rõ ràng của sản phẩm thế 2 lần vì với 1 phân tử 7 mắt xích (βCD), trong thực tế đã xảy ra 9 lần thế đƣợc ghi nhận thì ít nhất đã có 2 mắt xích xảy ra q trình thế 2 lần. Kết quả này trùng hợp với phân tích phổ NMR đã chỉ ra rất rõ sản phẩm đã đƣợc thế 2 lần (dựa vào sự tách thành 3 vạch của H-1 trong phổ 1H-NMR và C-1 trong phổ 13C-NMR)
Kết quả phổ khối của HPβCD tổng hợp phù hợp với mơ hình và sự phân bố các DS khác nhau trong cùng 1 sản phẩm đã đƣợc nghiên cứu bởi nhóm tác giả Josef Pitha, tuy nhiên số liệu phân tích ở đây chi tiết và rõ ràng hơn nhiều [50], [51].
So sánh với phổ MS của HPβCD thƣơng mại: khi sản xuất trong điều kiện khác nhau,
mơ hình thay thế cũng khác nhau, điều này thể hiện rất rõ ở phổ khối của HPβCD thƣơng