CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.4. Điều chế phức rutin-hydroxybutyl-β-cyclodextrin (R-HBβCD)
(R-HBβCD)
2.2.4.1. Xây dựng qui trình định lƣợng rutin trong phức R-HBβCD: tiến hành tƣơng tự nhƣ mục 2.2.3.1 nhƣng thay phức R-HPCD bằng phức R-HBCD.
2.2.4.2. Xác định ảnh hƣởng của HBβCD đến độ tan của rutin: pha hòa tan (tiến hành tƣơng tự nhƣ mục 2.2.3.2 nhƣng thay HPCD bằng HBCD)
2.2.4.3. Xác định tỷ lệ tạo phức giữa rutin và HBβCD: đƣợc điều chế theo tỷ lệ tính từ đồ thị pha hòa tan.
2.2.4.4. Điều chế phức R-HBβCD: bằng 2 phƣơng pháp: nghiền ƣớt và đồng bay hơi dung môi: tiến hành tƣơng tự nhƣ mục 2.2.3.4. môi: tiến hành tƣơng tự nhƣ mục 2.2.3.4.
2.2.4.5. Đánh giá phức R-HBβCD: thử độ hòa tan, độ tan, đo phổ IR, DSC, 1
H-NMR: tiến hành tƣơng tự nhƣ mục 2.2.3.5.
2.2.4.6. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở phức R-HBβCD: gồm các chỉ tiêu về tính chất, định tính, giảm khối lƣợng do làm khô, kim loại nặng, cắn sau khi nung, độ tinh khiết, giới hạn nhiễm khuẩn.
2.2.4.7. Xây dựng qui trình điều chế phức R-HBβCD
2.2.5. SO SÁNH ĐỘ HÕA TAN, ĐỘ TAN CỦA RUTIN TRONG PHỨC R-HBβCD VÀ RUTIN TRONG PHỨC R-HPβCD
2.2.6. ĐIỀU CHẾ PHỨC ITRACONAZOL-HYDROXYPROPYL-β-CYCLODEXTRIN (ITZ-HPβCD) CYCLODEXTRIN (ITZ-HPβCD)
2.2.6.1. Xây dựng qui trình định lƣợng itz trong phức ITZ-HPβCD Chuẩn bị mẫu:
Mẫu chuẩn: cân chính xác khoảng 5 mg itraconazol chuẩn, cho vào bình định mức 50 ml,
thêm 0,5 ml dimethylformamid, lắc đều, thêm 35 ml dung dịch HCl 0,1 N, lắc đều đến khi tan hoàn toàn, thêm dung dịch HCl 0,1 N đến vạch, lắc đều (dung dịch có nồng độ khoảng 100 μg/ml).
Mẫu thử: cân chính xác một lƣợng phức ITZ-HPβCD tƣơng ứng với khoảng 50 mg itz
cho vào bình định mức 10 ml, thêm 7 ml nƣớc cất nóng, lắc đều đến khi phức tan hết, để nguội, thêm nƣớc cất đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 μm. Lấy chính xác 1 ml dịch lọc trên, cho vào bình định mức 50 ml, thêm 35 ml dung dịch HCl 0,1 N lắc đều, thêm 0,5 ml dimethylformamid, thêm dung dịch HCl 0,1 N đến vạch, lắc đều (dung dịch có nồng độ qui về itraconazol khoảng 100 μg/ml).
Dung dịch HPβCD: cân chính xác khoảng 209,4 mg HPβCD (tƣơng ứng với lƣợng phức
ITZ-HPβCD chứa khoảng 50 mg itraconazol), cho vào bình định mức 10 ml, thêm 7 ml nƣớc cất nóng, lắc đều đến khi tan hết, để nguội, thêm nƣớc cất đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 μm. Lấy chính xác 1 ml dịch lọc trên cho vào bình định mức 50 ml, thêm 35 ml dung dịch HCl 0,1 N lắc đều, thêm 0,5 ml dimethylformamid, thêm dung dịch HCl 0,1 N đến vạch, lắc đều.
Mẫu kiểm tra: cân chính xác khoảng 50 mg itraconazol chuẩn, cho vào bình định mức 10
ml, thêm 7 ml nƣớc cất nóng, lắc đều, để nguội, thêm nƣớc cất đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Lấy chính xác 1 ml dịch lọc trên, cho vào bình định mức 50 ml, thêm 35 ml dung dịch HCl 0,1 N, lắc đều, thêm 0,5 ml dimethylformamid, thêm dung dịch HCl 0,1 N đến vạch, lắc đều.
Tiến hành: đo độ hấp thụ của mẫu chuẩn, mẫu thử, dung dịch HPβCD và mẫu kiểm tra
tại bƣớc sóng 254 nm, dùng dung dịch HCl 0,1 N có chứa 1% dimethylformamid làm mẫu trắng. Phép thử chỉ có giá trị khi độ hấp thụ của mẫu kiểm tra và dung dịch HPβCD tại bƣớc sóng 254 nm phải nằm trong khoảng ± 0,001.
Đánh giá qui trình: tính chọn lọc, khoảng tuyến tính, độ chính xác: tiến hành tƣơng tự
nhƣ mục 2.2.3.1
2.2.6.2. Xác định ảnh hƣởng của HPβCD đến độ tan của itz
Pha hòa tan: cho lƣợng dƣ itz (1 g) vào dãy dung dịch HPβCD có thể tích 50 ml, nồng
độ tăng dần 0 mmol, 10 mmol, 20 mmol, 30 mmol, 40 mmol khuấy hồi lƣu 400 vòng/phút trong 60 phút, để ổn định trong 24 giờ, lọc hỗn hợp qua màng lọc 0,45 μm. Pha loãng dịch lọc bằng dung dịch HCl 0,1 N đến nồng độ thích hợp, đo phổ UV ở bƣớc sóng 254 nm. Dựa vào đồ thị pha hòa tan đánh giá ảnh hƣởng của HPβCD đến độ tan của itz.
2.2.6.3. Xác định tỷ lệ tạo phức giữa itz và HPβCD
Tỷ lệ tạo phức giữa itz và HPβCD đƣợc ngoại suy từ đồ thị pha hòa tan.
2.2.6.4. Điều chế phức ITZ-HPβCD
Phƣơng pháp nghiền ƣớt: cân itz và HPβCD theo tỷ lệ mol đã đƣợc xác định, nghiền
trộn đều trong cối sứ, thêm ethanol 96o vào hỗn hợp, nghiền trộn trong 60 phút tạo thành khối nhão. Sấy hỗn hợp ở 40 oC dƣới áp suất giảm đến khối lƣợng không đổi.
Phƣơng pháp đồng bay hơi dung môi: cân itz, HPβCD, trộn đều thành hỗn hợp bột, cho
vào bình cầu, thêm ethanol 96o vào, khuấy hồi lƣu, thêm từng giọt acid HCl 0,1 M đến khi dung dịch trong suốt, khuấy hồi lƣu 400 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 6 giờ. Dung dịch đƣợc cô thu hồi ethanol ở nhiệt độ 40 oC dƣới áp suất giảm, cắn sấy ở 40 o
C dƣới áp suất giảm đến độ ẩm qui định.
2.2.6.5. Đánh giá phức ITZ-HPβCD Thử độ hòa tan:
Tiến hành trên máy thử độ hịa tan kiểu cánh khuấy. Mơi trƣờng: 900 ml dung dịch HCl 0,1 N, nhiệt độ: 37 ± 0,5 oC, tốc độ khuấy: 50 vòng/phút. Tiến hành tƣơng tự nhƣ mục 2.2.3.5
Thử độ tan: cho 2,5 g itz (dƣ) hay lƣợng phức ITZ-HPβCD tƣơng ứng với 2,5 g itz vào
bình nón nút mài chứa 100 ml HCl 0,1 N. Lắc trên máy lắc rung 100 vòng/phút trong 36 giờ, lọc hỗn hợp qua màng lọc 0,45 μm. Pha loãng dịch lọc bằng dung dịch HCl 0,1 N đến nồng độ thích hợp. Đo độ hấp thụ UV ở bƣớc sóng 254 nm, xác định độ tan của itz và phức ITZ-HPβCD.
Phổ IR, phổ DSC: tiến hành tƣơng tự nhƣ mục 2.2.3.5.
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H-NMR): 1H-NMR của itz và phức ITZ-HPβCD đƣợc đo trong dung môi DMSO, tần số đo 500 MHz, T = 300 K.
2.2.6.6. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở phức ITZ-HPβCD: gồm các chỉ tiêu về tính chất,
định tính, giảm khối lƣợng do làm khơ, kim loại nặng, cắn sau khi nung, độ tinh khiết, giới hạn nhiễm khuẩn.
2.2.6.7. Xây dựng qui trình điều chế phức ITZ-HPβCD
2.2.7. ĐIỀU CHẾ PHỨC ITRACONAZOL-HYDROXYBUTYL-β-CYCLODEXTRIN (ITZ-HBβCD) CYCLODEXTRIN (ITZ-HBβCD)
2.2.7.1. Xây dựng qui trình định lƣợng itz trong phức ITZ-HBβCD: tiến hành tƣơng tự nhƣ mục 2.2.6.1.
2.2.7.2. Xác định ảnh hƣởng của HBβCD đến độ tan của itz: pha hòa tan tiến hành tƣơng tự nhƣ mục 2.2.6.2.
2.2.7.3. Xác định tỷ lệ tạo phức giữa itz và HBβCD: tỷ lệ tạo phức giữa itz và HBβCD đƣợc ngoại suy từ đồ thị pha hòa tan.
2.2.7.4. Điều chế phức ITZ-HBβCD: bằng 2 phƣơng pháp: nghiền ƣớt và đồng bay hơi dung môi. Tiến hành tƣơng tự nhƣ mục 2.2.6.4.
2.2.7.5. Đánh giá phức ITZ-HBβCD: thử độ hòa tan, độ tan, đo phổ: IR, DSC, 1H-NMR: tiến hành tƣơng tự nhƣ mục 2.2.6.5.
2.2.7.6. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở phức ITZ-HBβCD: gồm các chỉ tiêu về tính chất, định tính, giảm khối lƣợng do làm khơ, kim loại nặng, cắn sau khi nung, độ tinh khiết, giới hạn nhiễm khuẩn.
2.2.7.7. Xây dựng qui trình điều chế phức ITZ-HBβCD
2.2.8. SO SÁNH ĐỘ HÕA TAN, ĐỘ TAN CỦA ITZ TRONG PHỨC ITZ-HBβCD VÀ ITZ TRONG PHỨC ITZ-HPβCD.
2.2.9. ĐIỀU CHẾ PHỨC MELOXICAM-HYDROXYPROPYL-β-CYCLODEXTRIN (ME-HPβCD) CYCLODEXTRIN (ME-HPβCD)
2.2.9.1. Xây dựng qui trình định lƣợng meloxicam trong phức ME-HPβCD Chuẩn bị mẫu
Mẫu chuẩn: cân chính xác khoảng 5 mg meloxicam chuẩn, cho vào bình định mức 50 ml,
thêm 35 ml dung dịch đệm phosphat pH 6,5 lắc đều đến khi tan hoàn toàn, thêm dung dịch đệm phosphat pH 6,5 đến vạch, lắc đều (dung dịch có nồng độ khoảng 100 μg/ml).
Mẫu thử: cân chính xác một lƣợng phức ME-HPβCD tƣơng ứng với khoảng 50 mg ME,
cho vào bình định mức 10 ml, thêm 7 ml nƣớc cất, lắc đều đến khi phức tan hết, thêm nƣớc cất đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 μm. Lấy chính xác 1 ml dịch lọc trên, cho vào bình định mức 50 ml, thêm dung dịch đệm phosphat pH 6,5 đến vạch, lắc đều (dung dịch có nồng độ qui về meloxicam khoảng 100 μg/ml).
Dung dịch HPβCD: cân chính xác khoảng 210,3 mg HPβCD (tƣơng ứng với lƣợng phức
ME-HPβCD chứa khoảng 50 mg meloxicam), cho vào bình định mức 10 ml, thêm 7 ml
nƣớc cất, lắc đều đến khi tan hết, thêm nƣớc cất đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 μm. Lấy chính xác 1 ml dịch lọc trên, cho vào bình định mức 50 ml, thêm dung dịch
Mẫu kiểm tra: cân chính xác khoảng 50 mg meloxicam chuẩn, cho vào bình định mức 10
ml, thêm 7 ml nƣớc cất, lắc đều, thêm nƣớc cất đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 μm. Lấy chính xác 1 ml dịch lọc trên, cho vào bình định mức 50 ml, thêm dung dịch
đệm phosphat pH 6,5 đến vạch, lắc đều.
Tiến hành: đo độ hấp thụ của mẫu chuẩn, mẫu thử, dung dịch HPβCD và mẫu kiểm tra
tại bƣớc sóng 363 nm, dùng dung dịch đệm phosphat pH 6,5 làm mẫu trắng. Phép thử chỉ có giá trị khi độ hấp thụ của mẫu kiểm tra và dung dịch HPβCD tại bƣớc sóng 363 nm phải nằm trong khoảng ± 0,001.
Đánh giá qui trình: tính chọn lọc, khoảng tuyến tính, độ chính xác: tiến hành tƣơng tự
nhƣ mục 2.2.3.1
2.2.9.2. Xác định ảnh hƣởng của HPβCD đến độ tan của ME
Pha hòa tan: cho một lƣợng dƣ ME (0,4 g) vào 20 ml các dung dịch HPβCD trong nƣớc
có nồng độ tăng dần từ 0 - 48 mmol, lắc trên máy lắc rung 100 vòng/phút trong 24 giờ, lọc hỗn hợp trên qua màng lọc 0,45 μm, pha loãng dịch lọc bằng dung dịch đệm phosphat pH 6,5 đến nồng độ thích hợp, đo phổ UV ở bƣớc sóng 363 nm. Dữ liệu pha hòa tan đƣợc thể hiện bằng đồ thị để đánh giá sự ảnh hƣởng của HPβCD đến độ tan của ME.
2.2.9.3. Xác định tỷ lệ tạo phức giữa ME và HPβCD.
Tỷ lệ tạo phức giữa ME và HPβCD đƣợc ngoại suy từ đồ thị pha hòa tan.
2.2.9.4. Điều chế phức ME-HPβCD
Phƣơng pháp nghiền ƣớt: cân ME và HPβCD theo tỷ lệ mol đã đƣợc xác định cho vào
cối sứ, trộn đều trong 15 phút, thêm dung môi ethanol 96o : nƣớc (1 : 1) vào nghiền trộn hỗn hợp trong 60 phút tạo thành bột nhão. Sấy hỗn hợp ở 70 oC đến khối lƣợng không đổi.
Phƣơng pháp đồng bay hơi dung môi: cho ME vào trong bình cầu, cho ethanol 96o vào, gia nhiệt đến 60 oC, khuấy đều, nhỏ từng giọt nƣớc amoniac 25% vào tới khi ME tan hoàn toàn, hạ đến nhiệt độ phòng, cho từ từ vào dung dịch HPβCD trong ethanol 96o, khuấy hồi lƣu 400 vịng/phút trong 6 giờ, cơ thu hồi ethanol ở nhiệt độ 70 oC dƣới áp suất giảm. Cắn sấy ở 70 o
2.2.9.5. Đánh giá phức ME-HPβCD Thử độ hòa tan
Độ hòa tan của ME và phức ME-HPβCD điều chế bằng các phƣơng pháp khác nhau đƣợc thử với máy thử độ hịa tan kiểu cánh khuấy. Mơi trƣờng: 900 ml dung dịch đệm phosphat pH 6,5, tốc độ khuấy 50 vòng/phút, nhiệt độ 37 ± 0,5 o
C. Tiến hành tƣơng tự nhƣ mục 2.2.3.5.
Thử độ tan: Cho một lƣợng dƣ ME (0,4 g) hoặc phức ME-HPβCD chứa lƣợng ME tƣơng
ứng vào các bình nón nút mài chứa 20 ml nƣớc cất. Lắc trên máy lắc rung 100 vòng/phút trong 24 giờ, lọc qua màng lọc 0,45 μm, pha lỗng dịch lọc đến nồng độ thích hợp bằng dung dịch đệm phosphat pH 6,5. Đo độ hấp thụ UV ở bƣớc sóng 363 nm. Xác định độ tan trong nƣớc của ME và ME trong phức ME-HPβCD.
Phức có độ hịa tan và độ tan cao nhất đƣợc tiếp tục thử nghiệm bằng đo phổ IR, DSC: Tiến hành tƣơng tự nhƣ mục 2.2.3.5.
Phổ 1H-NMR đo trong DMSO, tần số đo 500 MHz, T = 300 K, phân tích phổ để xác định cấu trúc phức ME-HPβCD.
2.2.9.6. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở phức ME-HPβCD: gồm các chỉ tiêu về tính chất,
định tính, giảm khối lƣợng do làm khơ, kim loại nặng, cắn sau khi nung, độ tinh khiết, giới hạn nhiễm khuẩn.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. TỔNG HỢP 2-HYDROXYPROPYL-β-CYCLODEXTRIN (HPβCD) 3.1.1. Qui trình tổng hợp 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin 3.1.1. Qui trình tổng hợp 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin
Cơ chế phản ứng tổng hợp HPβCD đƣợc thể hiện trong sơ đồ 3.1.
Sơ đồ 3.1. Cơ chế phản ứng tổng hợp 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin. (*) phản ứng có
thể xảy ra ở cả vị trí OH-C-2 và OH-C-3.
(a) (b)
Hình 3.1. Sắc ký đồ của HPβCD tổng hợp so với βCD (a) và so với HPβCD thƣơng mại
Sắc ký đồ của βCD là 1 vết tròn với Rf = 0,27, HPβCD tổng hợp có Rf = 0,72 và khơng còn vết của βCD. Sắc ký đồ của HPβCD tổng hợp so với HPβCD thƣơng mại có hình dạng tƣơng tự nhau với Rf tƣơng đƣơng.
Thăm dò ảnh hƣởng của nồng độ NaOH đến hiệu suất và DS của phản ứng:
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ NaOH đến hiệu suất và DS của phản ứng tổng hợp
HPβCD (n = 3)
Nồng độ NaOH 1% 1,5% 1,75% 2%
Hiệu suất (%) 0* 77,12 ± 0,02 70,34 ± 0,04 61,60 ± 0,01 DS - 5,46 ± 0,012 5,04 ± 0,008 4,57 ± 0,007 *βCD sau 1 giờ không tan hết, dung dịch cịn đục nên khơng tiến hành phản ứng.
Từ kết quả bảng 3.1, lấy nồng độ NaOH 1,5% để làm môi trƣờng cho các phản ứng tiếp theo.
3.1.2. Xác định cấu trúc của HPβCD tổng hợp
Phổ IR: cực đại hấp thụ của HPβCD tổng hợp có số sóng đặc trƣng của các nhóm chức:
OH, C-H, C-O.
Bảng 3.2. So sánh phổ IR của HPβCD tổng hợp và HPβCD thƣơng mại
Nhóm chức Đỉnh hấp thụ (cm -1) HPβCD tổng hợp HPβCD thƣơng mại O-H 3384,8 3384,8 C-H 2929,7 2927,7 C-O 1031,8 1031,8
Phổ IR của HPβCD tổng hợp và HPβCD thƣơng mại (phụ lục 3, hình PL. 3.1 và phụ lục 4, hình PL. 4.1) có các đỉnh cực đại hấp thụ tƣơng tự nhau.
Phổ NMR: (D2O, δppm) (phụ lục 4 hình PL.4.2 – 4.7)
Bảng 3.3. So sánh độ dịch chuyển hóa học phổ 1H và 13C-NMR của HPβCD tổng hợp và HPβCD thƣơng mại (phụ lục 3 hình PL.3.2 – PL.3.3 và phụ lục 4 hình PL.4.2 – 4.3) Vị trí HPβCD tổng hợp HPβCD thƣơng mại 13 C-NMR 1H-NMR 13C-NMR 1H-NMR 1 101,76 5,16 101,81 5,00 2 72,13 3,72 72,08 3,56 3 73,15 4,03 73,10 3,88 4 80,96 3,67 81,10 3,52 5 71,88 3,94 71,83 3,74 6 60,41 3,96 60,32 3,79 1′1,2 (a) 76,93 3,81 76,93 3,76 1′1,2 (b) 76,27 3,61 76,22 3,46 2′1 66,78 4,10 66,70 3,40 2′2 66,34 4,09 66,40 3,90 3′1 18,42 1,11 không tách vạch 18,33 1,07 không tách vạch 3′2 18,08 18,07
Từ kết quả so sánh ở bảng 3.3 cho thấy 2 mẫu có sự khác biệt nhỏ về độ dịch chuyển hóa học của δ1H và δ13
C, sự khác biệt này là do 2 sản phẩm có DS khác nhau. Từ kết quả so sánh độ dịch chuyển hóa học của phổ 1H và 13C-NMR có thể kết luận sản phẩm HPβCD đã đƣợc tổng hợp có cấu trúc đúng nhƣ dự kiến.
Phổ khối (MS): HPβCD tổng hợp có các đồng phân có khối lƣợng phân tử tƣơng ứng với
3.1.3. Xác định các yếu tố của phản ứng ảnh hƣởng đến hiệu suất và DS của sản phẩm tổng hợp
Vận tốc khuấy:
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của vận tốc khuấy đến hiệu suất và DS của phản ứng tổng hợp
HPβCD
Vận tốc (vòng/phút) 400 600 800 1000 1200 Hiệu suất (%) 78,13 79,36 79,49 79,30 78,46
DS 5,37 5,60 5,67 5,65 5,67
Biểu đồ 3.1. Ảnh hƣởng của vận tốc khuấy đến hiệu suất và DS của phản ứng tổng hợp
HPβCD.
Dựa vào kết quả phân tích trong bảng 3.4 và biểu đồ 3.1 có thể thấy khi thay đổi vận tốc khuấy sẽ dẫn đến hiệu suất và DS bị thay đổi, hiệu suất đạt giá trị cao khi vận tốc khuấy trong khoảng 600 - 1000 vòng/phút, khi vận tốc khuấy tăng trên 1000 vịng/phút thì DS tăng nhƣng hiệu suất giảm. Vì vậy, trong nghiên cứu quy trình tổng hợp khoảng vận tốc khuấy đƣợc khảo sát là 600 - 1000 vòng/phút.
Nhiệt độ của phản ứng
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hiệu suất và DS của phản ứng tổng hợp HPβCD