2.1.1. Địa điểm và sinh cảnh của KVNC
Các mẫu nghiên cứu được thu tại VQG Cúc Phương, tỉnh Ninh Bình theo tuyến xuất phát từ cửa rừng với bán kính khoảng 50 m theo đường chính đến trung tâm rừng, sau đó chia theo 2 tuyến: tuyến cây sấu và tuyến cây trò ngàn năm.
Tại RNS Mường Phăng, tỉnh Điện Biên, các mẫu được thu theo tuyến xuất phát từ cửa rừng đi theo đường chính đến hầm chỉ huy của chiến dịch Điện Biên Phủ 1954, chia thành 2 tuyến: tuyến 1 theo đường mòn đi xuyên rừng lên đỉnh thứ nhất, tuyến 2 theo hướng phải lên đỉnh thứ 2. Chúng tôi tiến hành thu mẫu với bán kính khoảng 50 m theo tuyến thu.
2.1.2. Thời gian nghiên cứu
Chúng tôi tiến hành thu mẫu từ năm 2009 đến năm 2012, thời gian nghiên cứu được thể hiện tại Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Thời gian các đợt nghiên cứu thực địa Tại RNS Mường Phăng Tại VQG Cúc Phương Đợt Thời gian (tháng/năm) Số ngày Đợt Thời gian (tháng/năm) Số ngày 1 5/2010 3 1 10/2009 2 2 7/2010 3 2 6/2010 2 3 10/2010 3 3 8/2010 2 4 6/2011 3 4 6/2011 2 5 11/2011 3 5 9/2011 2 6 12/2011 2 7 8/2012 2
Xen kẽ với các đợt thực địa, chúng tôi tiến hành phân tích đặc điểm hình thái, định loại và nghiên cứu tính đa dạng sinh học của nấm túi họ Xylariaceae tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ sinh học - Vi Sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội.
Formatted: Vietnamese
Formatted: Vietnamese Deleted: vườn Quốc gia
Deleted: rừng nguyên sinh
Deleted: rừng nguyên sinh
2.1.3. Vật liệu nghiên cứu
2.1.3.1. Mẫu nghiên cứu
Tổng cộng đã có 830 mẫu được thu thập từ 02 KVNC, trong đó có 526 mẫu đủ tiêu chuẩn cho nghiên cứu định loại. Các mẫu vật được bảo quản và lưu trữ tại phòng thí nghiệm của Bộ môn Công nghệ sinh học - Vi Sinh, Khoa Sinh học, Trường đại học Sư phạm Hà Nội.
2.1.3.2. Các dòng tế bào
Sử dụng các dòng tế bào ung thư ở người tại phòng thử hoạt tính sinh học, Viện Hóa học, bao gồm:
– KB(Human epidermic carcinoma): ung thư biểu – HepG2(Hepatocellular carcinoma): ung thư gan. – Lu(Human lung carcinoma): ung thư phổi. –MCF7(Human breast carcinoma): ung thư vú.
2.1.3.3. Vi sinh vật
Sử dụng các chủng vi sinh vật kiểm định ở phòng thử hoạt tính sinh học, Viện Hóa học, bao gồm:
Vi khuẩn: Gram (-) Pseudomonas aeruginosa (Pa) ATCC 15442 E. Coli (Ec) ATCC 25922
Gram (+) Staphylococcus aureus (Sa) ATCC 13709 Bacillus subtillis (Bs) ATCC 6633 Nấm: Candida albicans (Ca) ATCC 10198
2.1.3.4. Hóa chất
Dầu soi kính (Đức), thuốc nhuộm Melzer’s (Merck - Đức), KOH 10%, isopropanol, NaCl, chloroform, isoamyl, axit acetic, tris base, agarose, agar, nước cất 2 lần (vô trùng), nước cất 2 lần khử ion và vô trùng, cồn 70o. PCR master mix;
Formatted: Portuguese (Brazil)
Deleted: Vi khuẩn: Gram (-)
Pseudomonas aeruginosa, E. coli ¶ Gram (+) Staphylococcus aureus, Bacillus subtillis ¶
Mồi ngược: ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’); Mồi xuôi: ITS5 (5’- GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’);
Sắc ký bản mỏng phân tích: sử dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel F254 (Merck) có độ dày 0,2 mm. Sắc ký cột thường: sử dụng silica gel cỡ hạt 197 - 400 mesh (0,040 - 0,063) cho cột đầu, silica gel cỡ hạt 70 - 200 mesh cho các cột tiếp theo. Sắc ký cột pha đảo dùng RP-18; sắc ký lọc gel dùng Sephadex LH-20 (Merck). Các hóa chất: pyridin, N,N-dimetylaminopyridin (DMAP), anhiđrit axetic (Merck). Dung môi được cất lại qua cột Vigreux trước khi sử dụng.
2.1.3.5. Thiết bị
- Kính hiển vi quang học Carl zeiss (Đức): Axioskop 40; kính lúp soi nổi hiệu Carl zeiss (Đức): Stemi 2000C; máy ảnh kỹ thuật số Coolpix 4500 (Nhật), canon IXY 400F (Nhật); máy thu GPS Juno ST hiệu Trimble; tủ sấy, tủ ấm Binder (Đức); buồng cấy vô trùng; máy chưng cất nước cất hai lần (Hamilton- Anh); nồi hấp vô trùng Tomy (Nhật); máy khử ion Millipore (Pháp); bộ thiết bị điện di ngang Bio- Rad (Mĩ); máy luân nhiệt PCR Gene Amp PCR System 9700 (Mĩ); bộ thiết bị đọc gel ETX – 20X – EEC (Mĩ); lò vi sóng Sharp (Nhật); máyVortex MS1 Minishaker IKA (Đức); máy ổn nhiệt Kubota Sigma (Đức); máy làm đá vảy Brema (Italia); máy đo pH; tủ lạnh sâu - 30oC; máy li tâm Eppendorf (Đức).
- Bình tam giác, đĩa Petri, ống nghiệm, bình Schott Duran (Đức), khoan lỗ thạch, lam kính, lamen, dao lam, kéo, panh siêu nhỏ Venus (Thụy sĩ), pipet định mức; đầu côn các loại; ống PCR; ống Eppendorf (1,5 ml, 2,0 ml), ống Falcon 15ml, 50 ml; găng tay, giấy thấm, phễu lọc vi khuẩn 0,45 µm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Phổ hồng ngoại FT-IR được đo dưới dạng viên nén KBr bằng máy IMPACT-410, Nicolet-Carl Zeiss Jena (Đức) tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi trên máy Bruker Avance 500; [500 MHz (1H-) và 125 MHz (13C-). TMS (δ = 0,0); CD3OD
Formatted: Line spacing: Multiple
(δ = 49,0 ppm); CDCl3 (δ = 77,0 ppm)] tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Khối phổ EI-MS ghi trên máy 5989BMS Engine (Hewlett Packard). Khối phổ ESI-MS được đo trên máy Agilent LC-MSD-Trap SL tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS được đo trên máy FT-ICR-MS (USA), tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.1.3.6. Môi trường
- Môi trường phân lập (thạch nước): Thạch: 6g; nước cất: 1000ml. - Môi trường nuôi cấy và giữ giống nấm là PDA (Potato Dextrose Agar): Khoai tây: 250g, nước cất: 1000ml; Glucose: 20g; thạch: 16g; pH = 5,5 – 6.
- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn thử hoạt tính sinh học các hợp chất: MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton Agar), TSB (Tryptic Soy Broth), TSA (Tryptic Soy Agar).
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp vi sinh
2.2.1.1.Thu thập và xử lý mẫu * Thu thập mẫu [11]
Mẫu được thu thập một cách ngẫu nhiên tại các địa điểm trong khu vực nghiên cứu, trong đó ưu tiên quan sát ở các phần khác nhau của cây đang bị phân hủy và có dấu hiệu xuất hiện của nấm túi họ Xylariaceae.
Cách thu: Đối với những mẫu sống trên thân gỗ lớn, phải dùng dao nhọn hay rìu để tách chúng ra khỏi thân cây. Khi tách cần lấy cả một phần nhỏ giá thể mà nấm sống, ghi chép ngày thu, giá thể, vị trí, độ cao (vị trí các địa điểm thu mẫu được ghi lại theo số liệu kinh độ, vĩ độ và độ cao so với mặt nước biển bằng sự hỗ trợ của máy thu GPS Juno STRuno, hãng Trimble). Mỗi mẫu thu được để riêng trong một bao và có nhãn hiệu riêng. Không dùng túi ni lông để đựng mẫu vì không thoát khí và hơi nước được sẽ tạo điều kiện cho
nấm mốc và vi khuẩn phát triển. Sau đó các mẫu được mang về phòng thí nghiệm để nghiên cứu.
* Xử lý mẫu
Tại phòng thí nghiệm mẫu được bày lên bàn theo thứ tự đánh số từ nhỏ đến lớn, các mẫu chưa phân tích ngay sẽ được để khô tự nhiên. Thời gian phân tích mẫu tập trung trong khoảng 1 tuần, sau đó các mẫu được sấy khô và bảo quản lâu dài. Một lượng nhỏ chất diệt côn trùng như băng phiến được sử dụng để ngăn cản côn trùng và vi sinh vật làm hư hại mẫu vật. Những mẫu bị đất bám nhiều có thể dùng nước vô trùng rửa sạch và để ráo bề mặt mẫu rồi mới tiến hành ủ hoặc bảo quản khô.
2.2.1.2. Phương pháp phân lập nấm
Tiến hành phân lập các mẫu nấm họ Xylariaceae thu được, theo Ho và Ko (1997) [46], gồm các bước sau:
Bước 1: Tiến hành khử trùng bằng cách xịt cồn 70o lên trên bề mặt mẫu trong 1-2 phút nhằm tiêu diệt những vi sinh vật bám ở bề mặt mẫu nấm.
Bước 2: Dùng dao lam cắt ngang hoặc dọc thể quả, quan sát trên kính lúp soi nổi vị trí của các túi bào tử trong thể quả. Dùng panh nhỏ gắp những phần có chứa bào tử chuyển vào trong đĩa Petri chứa môi trường thạch nước, cấy làm 6 điểm, kiểm tra định kỳ sau 16 giờ về khả năng nảy mầm của bào tử, mức độ nảy mầm dưới kính hiển vi.
Bước 3: Dùng que cấy vô trùng chuyển các bào tử nảy mầm sang môi trường PDA, tiếp tục kiểm tra độ thuần của giống và chuyển vào trong ống nghiệm để giữ giống.
2.2.1.3. Bảo quản các chủng nấm phân lập được
Các ống nghiệm chứa giống nấm đã thuần sau 4 - 5 ngày nuôi cấy sẽ được bảo quản ở 40C trong tủ lạnh. Cấy truyền định kỳ 2 - 4 tháng 1 lần. Thường xuyên kiểm tra, bảo quản giống nấm nhằm phục vụ cho những mục đích nghiên cứu tiếp theo [15].
2.2.1.4. Phương pháp phân tích đặc điểm hình thái, định loại mẫu nấm túi họ Xylariaceae.
Quan sát và ghi chép cẩn thận các đặc điểm hình thái, giải phẫu hiển vi của từng mẫu nấm nghiên cứu [55, 56, 133] bao gồm những bước như sau:
Bước 1: Quan sát và dùng thước đo kích thước chất nền (chiều dài, chiều rộng, chiều cao, phần hữu tính, phần cuống v.v…, tính theo đơn vị milimet) và có những nhận định ban đầu về màu hình dạng, màu sắc, trạng thái bề mặt của chất nền (nhẵn, xù xì, xẻ rãnh thẳng, nứt nẻ, có lớp ngoài, không có lớp ngoài, có các bào tử và cuống sinh bào tử vô tính đính kèm…).
Bước 2: Sử dụng kính lúp và kính lúp soi nổi ở độ phóng đại từ 5 – 40 lần để trực tiếp quan sát và mô tả vị trí thể quả (chìm, bán nổi, nổi), trạng thái lỗ miệng (dễ thấy, khó thấy, không thấy).
Bước 3: Dùng dao lam sắc cắt dọc chính giữa thể quả để xác định trạng thái mô bên trong của chất nền, trạng thái đỉnh, cuống, hình dạng và kích thước thể quả, độ dầy thành thể quả và mầu sắc thể quả. Xác định mầu trong phản ứng giữa KOH 10% với thể quả.
Bước 4: Dùng panh nhỏ gắp những cấu trúc chứa túi bào tử và bào tử bên trong thể quả, làm tiêu bản sống với nước. Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi ở các bội giác khác nhau. Xác định hình dạng, kích thước, màu sắc của túi bào tử, trạng thái xếp bào tử, thể gốc của túi bào tử… Xác định hình dạng, kích thước, màu sắc của bào tử túi, bề mặt bào tử, số lượng tế bào, các thể kèm của bào tử; hình dạng, kích thước, trạng thái rãnh mầm trên bào tử. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Xác định sự có mặt, hình dạng, kích thước của sợi vô tính (paraphyseshoặc pseudoparaphyses).
Bước 5: Sử dụng thuốc nhuộm Melzer’s nhỏ lên tiêu bản. Quan sát sự thay đổi màu sắc của các cấu trúc trong tiêu bản như đỉnh túi bào tử, bào tử. Nếu cấu trúc đỉnh chuyển sang màu xanh là dương tính (J+), nếu không là âm tính với thuốc nhuộm Melzer’s (J-).
Formatted: Vietnamese
Formatted: Line spacing: Multiple
Bước 6: Chuẩn bị một tiêu bản với dung dịch KOH 10%. Dùng panh siêu nhỏ gắp những cấu trúc chứa bào tử bên trong thể quả làm tiêu bản. Quan sát sự biến đổi, tách vỏ của bào tử.
Bước 7: Sử dụng máy ảnh kỹ thuật số hoặc vẽ tay để ghi lại những cấu trúc, đặc điểm cần thiết cho quá trịnh định loại và miêu tả đặc điểm chính của loài.
Bước 8: Định loại mẫu: Dựa trên các đặc điểm hình thái, đặc điểm giải phẫu hiển vi, đặc điểm hóa học của các mẫu nghiên cứu, dựa theo các khóa định loại để định loại mẫu nghiên cứu tới loài. Khi các mẫu được định loại đến loài, việc so sánh với đặc điểm của loài gốc là cần thiết để khẳng định mức độ chính xác của công tác định loại.
2.2.1.5. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các hợp chất hóa học [16, 139] Phương pháp pha loãng nồng độ: Phương pháp pha loãng nồng độ:
- Mẫu ban đầu được pha trong DMSO với nồng độ thích hợp theo yêu cầu và mục đích thử.
- Các mẫu được pha thành dãy các nồng độ khác nhau (từ 5 đến 10 nồng độ). - Mẫu ban đầu có nồng độ 40 mg/ml được pha loãng thành các nồng độ khác nhau (256 μg/ml; 64 μg/ml; 16 μg/ml; 4 μg/ml; 1 μg/ml) để thử hoạt tính với các chủng vi sinh vật.
- Chuẩn bị dung dịch vi sinh vật với nồng độ 5. 105 CFU/ml khi tiến hành thử.
- Lấy 10 μl dung dịch mẫu thử theo các nồng độ đã pha loãng, thêm 200 μl dung dịch vi sinh vật và nấm, ủ ở 370C, sau 24 giờ, đọc giá trị IC50, giá trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy Tecan (Genios) và phần mềm Raw data.
Chất đối chứng:
- Kháng sinh Ampicillin cho các chủng vi khuẩn Gram (+) và chủng vi khuẩn Gram (-) với giá trị IC50 trong khoảng 0,05 - 2 μg/ml.
Formatted: Vietnamese
Formatted: Vietnamese Deleted: g
- Hỗn hợp kháng sinh Penicillin, Streptomycin cho chủng vi khuẩn Gram (-) với giá trị IC50 trong khoảng 4 - 5 μg/ml.
- Amphotericin B cho nấm với giá trị IC50 trong khoảng 0,5 - 1 μg/ml.
2.2.1.6. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất hóa học [16, 139]
- Nuôi cấy tế bào: Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh thai bò (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 370 C; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đối). Tùy thuộc đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau.
- Thử độc tế bào: Cho 200 μl dung dịch tế bào ở nồng độ 3.104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường RPMI 1640 cho các dòng tế bào HepG2, MCF-7, KB; môi trường DMEM cho LU.
- Mẫu thử được xử lí với tế bào ở các nồng độ pha loãng khác nhau sao cho đạt đến nồng độ cuối cùng là 128 μg/ml; 32 μg/ml; 8 μg/ml; 2 μg/ml; 0,5 μg/ml. Ủ trong điều kiện 370C, 5% CO2 trong 3 ngày.
- Giếng đối chứng gồm 200 μl dung dịch tế bào nồng độ 3.104 tế bào/ml, ủ ở 370C, 5% CO2 trong 3 ngày, thêm 50 μl Methylthiazolyldiphenyl- tetrazolium bromide (MTT) (1 mg/ml pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh), ủ 370C trong 4 giờ.
- Loại bỏ môi trường, thêm 100 μl Dimethyl sulfoxide (DMSO), lắc đều, đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN.
* Tính kết quả:
OD (điều khiển) – OD (mẫu) GI % =
OD (điều khiển) x 100 GI%: Phần trăm kìm hãm sự phát triển (Growth Inhibition).
Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả GI% của tế bào bằng phần mềm máy tính Table curve.
Nếu mẫu IC50≤ 128 μg/ml được coi là có hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Mẫu thô có IC50≤ 50 μg/ml và hợp chất tinh sạch có IC50≤ 30 μg/ml được đánh giá là có hoạt tính mạnh gây độc tế bào.
2.2.2. Sinh học phân tử (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.2.1. Tách chiết ADN
Phương pháp biến đổi của Doyle & Doyle (không sử dụng phenol)[30]
- Bước 1: Lấy khoảng 300mg hệ sợi nấm cho vào mỗi ống Eppendorf 2.0ml.
- Bước 2: Bổ sung 250 µl 2X CTAB buffer [2% CTAB, 100 mM Tris- HCl, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, pH 8.0] cho mỗi mẫu. Sử dụng chày nghiền cho đến khi mẫu hoàn toàn đồng nhất.
- Bước 3: Bổ sung 250 µl 2X CTAB buffer cho mỗi mẫu và trộn bằng máy Vortex.
- Bước 4: Ủ ở 65oC trong 60 phút. Bước này giúp tách và hydrat hóa nucleic acid. Trong quá trình ủ, trộn ít nhất một lần bằng máy Vortex.
- Bước 5: Bổ sung cùng một thể tích (500 µl) chloroform - isoamyl alcohol (24: 1) vào mỗi mẫu. Giữ chặt nắp và lắc mạnh cho đến khi có dạng nhũ tương. Tiếp tục lắc theo định kì trong vài phút để duy trì dạng nhũ tương đó.
- Bước 6: Li tâm ở 13.000 vòng/phút trong 12 phút. Hút dịch nổi sang ống eppendorf mới.
- Bước 7: Tách lại mẫu lần thứ 2, sử dụng cùng một thể tích chloroform: isoamyl alcohol (500 µl). Lần này sẽ có ít chất bị nhũ hóa. Li tâm ở 13.000 vòng/phút trong 7 phút. Thu phần dịch nổi sau khi li tâm (lặp lại bước này từ 3 - 4 lần).
- Bước 8: Đánh giá lượng ADN thu được. Bổ sung 2/3 thể tích isopropanol giữ nắp và trộn nhẹ nhàng. Có thể thấy kết tủa màu trắng. Mẫu được để lạnh qua đêm ở - 20oC.
- Bước 9: Thu nhận kết tủa vào ngày hôm sau bằng cách li tâm ở 13.000 vòng/phút trong 7 phút. Loại bỏ isopropanol, giữ lại phần kết tủa. Bổ