Phương pháp biến đổi của Doyle & Doyle (không sử dụng phenol)[30]
- Bước 1: Lấy khoảng 300mg hệ sợi nấm cho vào mỗi ống Eppendorf 2.0ml.
- Bước 2: Bổ sung 250 µl 2X CTAB buffer [2% CTAB, 100 mM Tris- HCl, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, pH 8.0] cho mỗi mẫu. Sử dụng chày nghiền cho đến khi mẫu hoàn toàn đồng nhất.
- Bước 3: Bổ sung 250 µl 2X CTAB buffer cho mỗi mẫu và trộn bằng máy Vortex.
- Bước 4: Ủ ở 65oC trong 60 phút. Bước này giúp tách và hydrat hóa nucleic acid. Trong quá trình ủ, trộn ít nhất một lần bằng máy Vortex.
- Bước 5: Bổ sung cùng một thể tích (500 µl) chloroform - isoamyl alcohol (24: 1) vào mỗi mẫu. Giữ chặt nắp và lắc mạnh cho đến khi có dạng nhũ tương. Tiếp tục lắc theo định kì trong vài phút để duy trì dạng nhũ tương đó.
- Bước 6: Li tâm ở 13.000 vòng/phút trong 12 phút. Hút dịch nổi sang ống eppendorf mới.
- Bước 7: Tách lại mẫu lần thứ 2, sử dụng cùng một thể tích chloroform: isoamyl alcohol (500 µl). Lần này sẽ có ít chất bị nhũ hóa. Li tâm ở 13.000 vòng/phút trong 7 phút. Thu phần dịch nổi sau khi li tâm (lặp lại bước này từ 3 - 4 lần).
- Bước 8: Đánh giá lượng ADN thu được. Bổ sung 2/3 thể tích isopropanol giữ nắp và trộn nhẹ nhàng. Có thể thấy kết tủa màu trắng. Mẫu được để lạnh qua đêm ở - 20oC.
- Bước 9: Thu nhận kết tủa vào ngày hôm sau bằng cách li tâm ở 13.000 vòng/phút trong 7 phút. Loại bỏ isopropanol, giữ lại phần kết tủa. Bổ
sung 1 ml ethanol 70% vào mỗi ống Eppendorf và đảo cận thận. Li tâm ở 13.000 vòng/phút trong 7 phút, loại bỏ phần ethanol trên bề mặt (lặp lại 2 – 3 lần). Để khô ADN ở nhiệt độ phòng trong buồng cấy vô trùng. Bổ sung 50 µl TE buffer [10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8] vào mỗi ống. Bảo quản ở - 20oC để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.