CHƢƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.3 Nội dung nghiên cứu
2.3.2 Đánh giá sự tƣơng quan giữa gelatin và MTGase trong sản phẩm yogurt
2.3.2.1 Xây dựng mơ hình thực nghiệm
Chúng tơi sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt (Respone Surface Method – RSM). Mục tiêu của phương pháp RSM là tối ưu hóa các phản ứng và nó đã được áp dụng rộng rãi cho các quá trình khác nhau trong thực phẩm (Tang, 2016).
Độ axit, độ pH.
Đánh giá cảm quan.
Xác định độ tách whey
Xác định độ lưu biến, FTIR
Hình ảnh chụp FeSem.
Phân tích protein, chất béo, hàm lượng chất khô.
Một tổ hợp gồm 13 thí nghiệm được bố tr như ở mục bảng 2.3.
Xác định: Độ tách whey(%), protein hòa tan(mg/ml).
Đánh giá sự tương quan giữa gelatin và MTGase trong sản phẩm yogurt
Đánh giá ảnh hưởng của Gelatin và MTGase đến đặc điểm hóa lý và cơ lý của sản phẩm yogurt.
Phân tích thành phần hóa học của sữa bột nguyên liệu
27
Bề mặt phản hồi có thể được biểu diễn bằng đồ thị, trong không gian ba chiều hoặc dưới dạng một biểu đồ đường giúp hình dung hình dạng của nó. Một thiết kế thử nghiệm thường được sử dụng trong RSM là thiết kế mơ hình lặp tâm (Central Composite Design- CCD) (Montgomery, 1997). CCD là một thiết kế rất hiệu quả để lắp bề mặt đáp ứng bậc hai, phương trình hồi quy thực nghiệm theo phương pháp quy hoạch trực giao cấp hai cấu trúc có tâm có dạng (Nguyễn Tấn Dũng và cộng sự, 2017):
Y= β0 + ∑ + ∑ + ∑ (2.2) Trong đó:
b0, bj, bjj là các hệ số của phương trình hồi quy; xj, xi là các biến mã hóa của các yếu tố cơng nghệ;
λ là hệ số đưa vào ma trận thí nghiệm để hình thành ma trận có t nh trực giao. Các hệ số bj, bjl, bjj được xác định như sau (Nguyễn Tấn Dũng và cộng sự, 2017):
bj = ∑
∑ ; bjl = ∑
∑ ; bjj = ∑
(2.3)
- Ý nghĩa của các hệ số hồi quy (theo tiêu chuẩn Student)
- Sự tương th ch của phương tình hồi quy với thực nghiệm (theo tiêu chuẩn Fisher). Các biến mã hóa (x1, x2) thu được quy đổi qua giá trị thực (Z1, Z2) theo công thức:
Zj = (xj*ΔZj) + (2.4)
Khối tròn tổng hợp trung tâm (Central Composite Circumscribed- CCC): trong thiết kế CCC ba yếu tố, các mức cao (+1) và thấp (-1) được thể hiện ở góc của khối lập phương. Các điểm sao (star points) được dịch chuyển ra bên ngồi khơng gian ở cùng khoảng cách từ tâm điểm bằng khoảng cách từ tâm đến các góc (Tang, 2016).
28
Hình 2. 3: Mơ phỏng mơ hình Central Composite Circumscribed (Tang, 2016).
Qua kết quả tổng quan tài liệu (Jihan Putra Ramdhani, 2018; Dr. Ashna T. Abdulqadr, 2015; Zhihua Pang, 2014; Supavititpatana, 2008;... ), và thực nghiệm sơ bộ được tiến hành chúng tôi chọn hai yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng yogurt đó là: hàm lượng MTGase -Z1(%, g/100ml sữa), hàm lượng gelatin -Z2 (%, g/100ml sữa). Mục tiêu đặt ra là: y1- Độ tách whey (%), y2- Hàm lượng protein trong whey (mg/ml whey). Các hàm mục tiêu cần đạt được là y1min và y2min. Các đối tượng công nghệ trong nghiên cứu được thể hiện ở hình 2.4.
Hình 2. 4: Đối tượng cơng nghệ sản xuất yogurt
Số thí nghiệm (N) được xác định theo công thức (Nguyễn Tấn Dũng và cộng sự, 2017): N= 2k + 2k + no (2.4) Hộp đen Z1 nồng độ MTGase (g/g protein) Z2 nồng độ gelatin (g) Y1- Độ tách whey (%) Y2- Hàm lượng protein trong whey (mg)
29
Trong đó: k là số yếu tố công nghệ ảnh hưởng đến hàm mục tiêu (k=2), n0 là số thí nghiệm tại tâm.
Với k=2, no= 5 thế vào công thức ta được:
N= 22 + 2*2 + 5= 13 (thí nghiệm)
Cánh tay địn (α) được xác định theo cơng thức (khi k<5) (Nguyễn Tấn Dũng và cộng sự, 2017):
α = = 21/2= 1,414 (2.5)
T nh quay đồng đều đạt được khi chọn hằng số không vượt quá đơn vị (Nguyễn Tấn Dũng và cộng sự, 2017):
=
=
= 0,40625 (2.6)
Trong đó: nk = 2k : số thí nghiệm của phương án thực nghiệm yếu tố từng phần n* = nα = 2k : số thí nghiệm của phương án thực nghiệm ở điểm (*), điểm của các cánh tay địn;
no: số thí nghiệm của phương án thực nghiệm ở tâm (0).
Các mức yếu tố được trình bày trong bảng 2.2, bố trí 13 thí nghiệm sẽ trình bày trong bảng 2.3 Bảng 2. 2: Các mức yếu tố ảnh hưởng Các yếu tố - α (-1,414) Mức dưới (-1) Mức tâm(0) Mức trên(+1) +α (+1,414) Khoảng biến thiên ΔZ Z1(MTG, g/ g protein sữa 0,004 0,021 0,062 0,103 0,12 0,041 Z2(Gelatin, g) 0,128 0,2 0,375 0,55 0,622 0,175
30
Bảng 2. 3: Ma trận quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 2
STT M u
Biến thực Biến mã hóa
Z1(MTG, g/g
protein sữa) Z2(gelatin, g) Z1 Z2
1 0,021 0.2 -1 -1 2 0,103 0.2 1 -1 3 0,021 0.55 -1 1 4 0,103 0.55 1 1 5 0,004 0.375 -1.414 0 6 0,120 0.375 1.414 0 7 0,062 0.128 0 -1.414 8 0,062 0.622 0 1.414 9 0,062 0.375 0 0 10 0,062 0.375 0 0 11 0,062 0.375 0 0 12 0,062 0.375 0 0 13 0,062 0.375 0 0
2.3.2.2 Kiểm định ý nghĩa các hệ số hồi quy
Ý nghĩa các hệ số hồi quy được kiểm định theo tiêu chuẩn Student. Tiêu chuẩn Student được xác định theo công thức (Nguyễn Tấn Dũng và cộng sự, 2017):
tj = | |
(2.7)
Trong đó: bj là hệ số thứ j trong phương trình hồi quy
Sbj là phương sai của hệ số thứ j được tính theo cơng thức sau (Nguyễn Tấn Dũng và cộng sự, 2017):
√
∑ ; √
∑ ; √
31
Trong đó: là phương sai tái hiện (sai số tái hiện của các thí nghiệm được lặp lại ở cùng một điều kiện), được tính theo cơng thức sau (Nguyễn Tấn Dũng và cộng sự, 2017):
∑ ̅
(2.9)
So sánh giá trị tj theo thực nghiệm với giá trị tb ở bảng tra phân vị phân bố Student (Nguyễn Tấn Dũng và cộng sự, 2017).
Nếu :
- tj < tb (f2) thì hệ số bj loại khỏi mơ hình tốn học.
- tj > tb (f2) thì hệ số được chấp nhận trong mơ hình tốn học.
2.3.2.3 Kiểm định tiêu chuẩn Fisher:
F =
(2.10)
Trong đó: là phương sai dư để xác định t nh tương th ch giữa giá trị thực nghiệm
thu được với giá trị tính theo lý thuyết. Phương sai dư được tính theo cơng thức sau (Nguyễn Tấn Dũng và cộng sự, 2017):
= ∑ ̂ (2.11)
Nếu F < F1-p(f1,f2) thì phương trình hồi quy tương th ch với mơ hình thực nghiệm, ngược lại thì khơng tương th ch, phải chọn lại mơ hình trực giao thực nghiệm khác thích hợp.
Ý nghĩa của các hệ số và t nh tương th ch của phương trình hồi quy được kiểm định lại bằng phần mềm Design Expert. Mơ hình và phương trình hồi qui được kiểm tra mức độ phù hợp với thực nghiệm bằng kiểm định Fisher của mơ hình (với giá trị = 0,05) và sự thiếu phù hợp (Lack of fit). Nếu giá trị Pvalue nhỏ hơn giá trị α và càng nhỏ thì mơ hình càng phù hợp. Hệ số “Lack of fit” phải lớn hơn giá trị α (lớn hơn 0,05) thì mơ hình đó mới phù hợp, giá trị “Lack of fit” càng lớn thì mức độ phù hợp của mơ hình càng tăng.
2.3.2.4 Giải bài tốn tối ƣu đơn mục tiêu
Bài toán tối ưu đơn mục tiêu được lập dựa trên phương trình hồi quy xác định bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm là hàm mô tả sự phụ thuộc của các yếu tố khảo sát sự bổ sung gelatin và MTGase trong yogurt. Điều kiện ràng buộc là giới hạn của vùng nghiên cứu. Phần mềm Design–Expert được sử dụng để mơ hình hóa thí nghiệm theo phương pháp đáp
32
ứng mơ hình bề mặt RSM, phân tích các kết quả thực nghiệm theo mơ hình và giải bài tốn tối ưu đơn mục tiêu. Cuối cùng, thực hiện việc phân tích tại điểm tối ưu với các điều kiện khảo sát và so sánh với kết quả dự đoán để kiểm tra sự chính xác của mơ hình dự đốn (thực nghiệm kiểm chứng).
2.3.3 Đánh giá ảnh hƣởng của Gelatin và MTGase đến đặc điểm hóa lý và cơ lý của sản phẩm yogurt phẩm yogurt phẩm yogurt
Mục đ ch: Xác định các chỉ tiêu để đánh giá chất lượng các m u yogurt.
Cách tiến hành: Ba m u đối chứng ĐC 1, ĐC 2, ĐC 3 tương ứng lần lượt là m u yogurt bổ sung MTGase, bổ sung gelatin và không bổ sung MTGase và gelatin,cùng với đó là 6 m u được chọn từ phương pháp đáp ứng bề mặt được xác định các chỉ tiêu độ tách whey, độ axit, độ pH, Đánh giá cảm quan, , xác định độ lưu biến, Phổ hồng ngoại- FTIR, hình ảnh chụp FeSem tiến hành theo mục 2.4.
2.4 Phƣơng pháp phân tích 2.4.1 Độ tách whey 2.4.1 Độ tách whey
Mục đ ch: Độ tách whey giúp xác định khả năng giữ nước của các m u yogurt.
Cách tiến hành: Cân chính xác khối lượng m u yogurt đến 0.1mg. Ly tâm ở 3500 vòng/ phút trong 15 phút. Sau đó, cân khối lượng whey ly tâm được và tính tốn theo cơng thức (Aprodu, 2011):
%Whey =
100 (2.12)
2.4.2 Xác định protein hòa tan
Chúng tơi xác định protein hóa tan bằng phản ứng Folin theo phương pháp Lowry (Lowry, 1951). Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để ước t nh lượng protein (đã có trong dung dịch hoặc dễ tan trong kiềm lỗng).
Nguyên tắc: Đầu tiên là protein được xử lý trước bằng ion đồng trong dung dịch alkalli sau đó các axit amin thơm trong m u được xử lý khử axit photphomolybdatephosphotungstic có trong thuốc thử Folin. Sản phẩm cuối cùng của phản ứng này có màu xanh lam. Lượng protein trong m u có thể được ước tính thơng qua việc đọc độ hấp thụ (ở bước sóng 750nm) của sản phẩm cuối cùng của phản ứng Folin so với đường chuẩn của dung dịch protein chuẩn đã chọn (trong trường hợp của chúng tôi là dung dịch Albumin Egg).
33
1. Pha dung dịch A, B, C theo công thức như sau:
A: 2,8598g NaOH + 14,3084g Na2CO3 định mức lên 500ml. B: 1,4232g CuSO4.5H2O định mức lên 100ml
C: 2,85299g Na2.Tartrate.2H2O định mức lên 100ml Sau đó trộn A:B:C (dung dịch Lowry) theo tỉ lệ 100:1:1
2. Pha 5ml Folin 2N với 6ml H2O ( pha mới trước khi ủ trong bình tối). 3. Pha dung dịch chuẩn
Cân 0,005g Albumin Egg định mức lên 10ml ta sẽ được dung dịch có nồng độ 500µg/ml.
Đưa vào ống nghiệm 15ml theo công thức sau:
Albumin(ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
H2O(ml) 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4
Dung dịch Lowry(ml)
1,4 1,4 1,4 1,4 1,4 1,4 1,4
Đậy nắp lại và lắc nhanh, sau đó ủ tối ở nhiệt độ phịng trong 20 phút.
4. Chuẩn bị dung dịch Folin ở mục 2, cho vào mỗi ống nghiệm 0,2ml dung dịch Folin mới pha. Đậy nắp lại và trộn nhanh sau đó ủ tối trong thời gian tối thiếu 30 phút ở nhiệt độ phòng.
5. Mở Uv-Vis làm ấm máy trước khi đo. Sau 30 phút lắc nhanh m u lần nữa và cho vào cuvet thủy tinh để đo.
2.4.3 Độ axit
Nồng độ axit lactic được tạo ra từ nuôi cấy trong yogurt được đo bằng phương pháp axit chuẩn độ theo tiêu chuẩn của Törner.
Cách tiến hành:
Trộn kỹ m u bằng thìa, hoặc sử dụng máy đồng hóa nhằm đảm bảo tính chính xác khi lấy m u. Cân khoảng 10 g m u vào cốc 50 ml, thêm khoảng 10 mL nước và trộn. Chuẩn độ sản phẩm trong cốc thủy tinh, được thực hiện bằng cách sử dụng NaOH 0,1 M với sự có mặt của 0,5 ml dung dịch ethanol phenolphtalein 1% làm chất chỉ thị cho điểm cuối của màu hồng nhạt. Ghi lại kết quả NaOH chuẩn độ được và tính tốn theo công thức (Katya Dimitrova, 2015):
34
o
T= V*10 (2.12)
Trong đó: V là ml NaOH thu được
2.4.4 Phân tích các đặc điểm lƣu biến học
Các đặc t nh lưu biến học được nghiên cứu bằng máy đo lưu biến Rheostress Drehkorper/ Rotor (Đức).
Mục đ ch: Xác định bản chất chất lỏng của các m u yogurt, đồng thời so sánh các đặc t nh lưu biến học của các sản phẩm này.
Cách tiến hành: Một phương pháp đo lưu biến được khảo sát và thiết lập từ trước. M u yogurt (1ml) được đặt vào vị tr đặt m u. M u được ổn định ở nhiệt độ 30o
C trong vòng 5 phút. Đo đạc ứng suất cắt (Shear stress – τ, Pa) và độ nhớt biểu kiến (Apparent viscosity –η, mPas) theo tốc độ cắt (Shear rate – , 1/s) từ 0-1000 (1/s). Mối quan hệ chung để mô tả hành vi của chất lỏng phi Newton (non-Newton) là mơ hình Herschel-Bulkley:
τ ( )n + (2.13)
Trong đó: Trong đó k là hệ số nhất quán, n là chỉ số hành vi dòng chảy và τ là ứng suất cắt. Mơ hình này thích hợp cho nhiều loại thực phẩm lỏng.
Hình 2. 5: Thiết bị đo lưu biến
2.4.5 Đo quang phổ hồng ngoại biến đổi chuỗi (Fourier Transform Infrared- FTIR)
Mục đ ch: Thực hiện phân tích định tính các m u sản phẩm yogurt bằng quang phổ hồng ngoại.
Cách tiến hành: Các m u yogurt được sấy khô bằng phương pháp sấy thăng hoa. Các m u được cấp đơng sâu (-80oC), sau đó sấy thăng hoa trong 48 giờ. Yogurt khơ được nghiền thành bột. Phổ FTIR của các m u yogurt được ghi lại bằng cách quét độ truyền qua
35
(Transmittance) các m u yogurt từ số sóng 4000–400 cm-1 bởi thiết bị máy đo phổ hồng ngoại biến đổi chuỗi Fourier FTIR. (Jaya, 2009)
2.4.6 Kính hiển vi điện tử quét trƣờng phát xạ (Field Emission Scanning Electron Microscopy-FESEM)
Mục đ ch: Quan sát hình thái của yogurt
Cách tiến hành: Các m u bột yogurt đơng khơ được phân tích bằng kính hiển vi điện tử quét trường phát xạ (FESEM). Các m u yogurt được gắn trên các thanh nhôm SEM với các mấu cacbon d n điện hai mặt và quan sát.
2.4.7 Phƣơng pháp phân tích thành phần hóa học
- Hàm lượng chất khô được xác định theo tiêu chuẩn TCVN 5533:1991 (Xem phụ lục 2).
- Hàm lượng protein trong sản phẩm yogurt được xác định bằng phương pháp Kjeldahl theo TCVN 8099-1:2015 (Xem phụ lục 2).
- Hàm lượng lipid được xác định bằng phương pháp Mojonnier theo TCVN 7084:2010 (Xem phụ lục 2).
2.4.8 Đánh giá cảm quan
Mục đ ch: So sánh mức độ tách nước của các m u yogurt tại nhiệt độ phòng.
Cách tiến hành: Dùng thìa coffee lấy một lượng yogurt bỏ trên bề mặt phẳng tối màu ở nhiệt độ phịng. Sau đó quan sát sự tách nước của m u trong thời gian 30 phút.
2.4.9 Phƣơng pháp xử lý dữ liệu
Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm Microsoft Excel 2016 và được xử lý thống kê theo kiểm định ANOVA trong phần mềm Minitab 16.
36
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 Thành phần hóa học của sữa nguyên liệu
Thành phần hóa học của sữa bột nguyên kem dùng để sản xuất yogurt trong nghiên cứu này đã được chúng tơi phân tích kiểm định. Kết quả xác định hàm lượng protein, lipid và độ ẩm được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3. 1: Thành phần hóa học của sữa nguyên liệu
Sản phẩm Thành phần hóa học
Protein,% Lipid,% Độ ẩm,%
Sữa bột nguyên kem Kết quả phân t ch 23,81 ± 0,02
28,20 ±
0,058 2,8 ± 0,02
Số liệu từ COA** 23.78 28.28 2.79
Dung dịch sữa hoàn nguyên (TS= 15%) 4,36±0,01 3,45±0,26 84,93±0,07
** Số liệu từ COA (Certificate of Analyst – Bảng phân tích thành phần của sản phẩm)
Kết quả phân t ch (bảng 3.1) cho thấy hàm lượng thành phần ch nh của sữa bột nguyên liệu tương th ch với số liệu nhà sản xuất cung cấp. Dung dịch sữa hồn ngun có hàm lượng protein đạt 4,36%, lipid – 3,45%, độ ẩm – 84,93% là nguyên liệu ch nh được dùng trong các th nghiệm tiếp theo.
3.2 Đánh giá sự tƣơng quan giữa gelatin và MTGase trong sản phẩm yogurt
Với ý định ban đầu là xây dựng được quy trình sản xuất yogurt có bổ sung MTGase và gelatin để có kết cấu gel bền hơn. Sau khi tổng quan tài liệu, phương pháp đáp ứng bề mặt được lựa chọn áp dụng trong nghiên cứu. Dựa trên thiết kế thí nghiệm trung tâm, mơ hình bậc hai biểu thị mối quan hệ giữa các yếu tố đầu vào (Hàm lượng MTGase - Z1 và Hàm lượng gelatin - Z2). Một số hàm mục tiêu được đặt ra: Y1- Độ tách whey (đạt giá trị thấp nhất), Y2- hàm lượng protein trong yogurt cao nhất (hàm lượng protein trong whey đạt giá trị thấp nhất).
Từ đó tiến hành xây dựng mơ hình tốn thực nghiệm trực giao cấp 2 để mơ tả cho q trình bổ sung MTGase và gelatin vào yogurt với k=2 và mơ hình thực nghiệm ở hình 2.4.
3.2.1 Xây dựng hàm mục tiêu về độ tách whey
Độ tách whey được coi là một khuyết điểm dễ thấy nhất của yogurt do quá trình khuấy lắc đảo trộn q mức hay đồng hóa khơng đạt (k ch thước các hạt cầu béo quá lớn)(Keogh & O'Kennedy, 1998). Nó ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm.
37
Số liệu t nh tốn được trình bày ở bảng 3.2, kết quả sau khi t nh tốn được các tham số của phương trình hồi quy.
Bảng 3. 2: Kết quả độ tách whey
Mẫu
Biến ảo Biến thực Hàm mục tiêu
Z1 Z2 Z1 (%) Z2 (%) Y1- Độ tách whey (%) 1 -1 -1 0,021 0,2 33,57±1,47cd