Thành phần Đơn vị Giá trị Protein % m/m 23,78 Lipid % m/m 28,28 Độ ẩm % m/m 2,79 Lactose % m/m 39 Khoáng % m/m 5,8 Vitamin A µg/100 g 736 Vitamin D3 µg/100 g 11
Nguồn: Số liệu từ COA (Certificate of Analyst– Bảng phân tích thành phần của sản phẩm)
22
Transglutaminase (Saprona Transglutaminase) 1E của C&P Enzymes (Germany), mua tại công ty cổ phần phát triển Khoa Học Công Nghệ Mỹ Úc, địa chỉ 783/40 đường Cách Mạng Tháng Tám, phường 6, quận Tân Bình, TP. Hồ Ch Minh được sử dụng trong nghiên cứu này.
Vi khuẩn lactic
Hỗn hợp vi khuẩn gồm 2 chủng Lactobacilus bulgaricus và Streptococus thermophilus của công ty Green lines (thành phố Krasnodo, Liên Bang Nga) được sử dụng trong nghiên cứu này.
Gelatin
Gelatin có xuất xứ tại Trung Quốc được mua tại Cơng ty TNHH Hóa Chất Long Hải, địa chỉ 3/1 đường Thành Thái, Phường 14, Quận 10, Thành phố Hồ Ch Minh được sử dụng trong nghiên cứu này.
2.1.3 Hóa chất
Natri hyroxide (NaOH), Axit clohydic (HCl) 0.1N, Axit sunfuric (H2SO4) đặc, Amoniac (NH3), Diethyl ether (C4H10O), Petroleum ether 60 – 90, Phenolphtalein (C20H14O4), Đồng(II) sunfat (CuSO4), Kali sunfat (K2SO4), Cồn 90o
, Natri Cacbonat( Na2CO3), Natri tartrate( Na2C4H4O6), Folin 2N.. được mua tại Cơng ty KD hóa chất thiết bị PTN Hóa Nam địa chỉ tại 239/4 Lý Thường Kiệt, Phường 5, Quận 11, TP.Hồ Chí Minh, Cơng ty cổ phần XNK hóa chất Đại Cát Lợi địa chỉ tại 22/76 Cư Xá Lữ Gia, P.15, quận 11, TP. Hồ Chí Minh.
2.1.4 Thiết bị sử dụng
pH kế Mettler Toledo (Canada)
Cân phân tích 4 số (Sartorious BL210S) Máy đồng hóa
Tủ sấy Memmert (Đức) Máy ly tâm Rotana 460 Tủ ủ, tủ lạnh, bếp điện
Hệ thống chưng cất Kjeldahl B-324 Buchi Máy đo lưu biến RS (Rheostress RS)
Máy quang phổ hồng ngoại biến đổi chuỗi Fourier FTIR, Nhật Bản. Máy quang phổ UH5300UV- Vis Spectrophotometer Hitachi, Nhật Bản
23
Các dụng cụ: Cốc đong, đĩa petri, erlen, micropipet, đầu típ, ống eppendorf, pipet, biuret, ống bóp cao su, đũa thủy tinh, bình xịt tia, nhiệt kế, máy lắc ống nghiệm.
24
T: 85 ºC t: 15 phút Hoàn nguyên
Phối trộn Sữa bột nguyên kem
Nước Thanh trùng Lên men Làm lạnh T: 50 oC t: 20 phút Yogurt Bảo quản Xử lí dịch sữa với enzyme Transglutaminase
Hình 2. 1: Quy trình sản xuất yogurt
Hàm lượng MTGase theo khảo sát T: 40 oC
Thời gian: 2 giờ
Gelatin
T: 30 oC
Hàm lượng gelatin theo khảo sát T: 15 phút T: 40oC pH: 4.6 Giống vi khuẩn khởi đầu T: 22±2oC T: 4±2oC
25
Thuyết minh quy trình:
- Hoàn nguyên:
Mục đ ch: Hoàn nguyên sữa bột trở lại trạng thái ban đầu như sữa tươi (dạng lỏng). Tổng hàm lượng chất khô mong muốn đạt 15%.
Cách tiến hành: Hoàn nguyên sữa với nước ở nhiệt độ 45-50oC trong thời gian 20 phút, lượng sữa hồn ngun được xác định theo cơng thức tổng quát sau(Bylund, 1995):
a = (2.1)
Trong đó: a là lượng sữa bột cần sử dụng (g)
b là hàm lượng chất khô đạt mong muốn (%)
c là hàm lượng chất khô trong 100 g sữa nguyên liệu (g)
-Phối trộn:
Mục đ ch: Phối trộn gelatin vào dung dịch sữa hoàn nguyên.
Cách tiến hành: Gelatin (khối lượng được xác định theo bảng 2.3) được hòa tan vào trong dung dịch sữa hoàn nguyên ở tại nhiệt độ 30oC, khuấy tan trong 15 phút.
- Xử lí dịch sữa với enzyme:
Mục đ ch: Tạo điều kiện để transglutaminase xúc tác phản ứng hình thành liên kết ngang giữa các axit amin trong dung dịch sữa nguyên liệu.
Cách tiến hành: Hỗn hợp sữa sau quá trình phối trộn được đưa về nhiệt độ 40o
C. Sau đó, hịa tan một lượng enzyme theo tỷ lệ khảo sát (bảng 2.3). Ủ tại 40oC trong thời gian 2h (Oner Z. A., 2008).
-Thanh trùng:
Mục đ ch: Tiêu diệt các vi sinh vật có trong hỗn hợp sữa, tạo điều kiện vơ trùng để lên men.
Cách tiến hành: Hỗn hợp sữa sau quá trình xử lý với enzyme được thanh trùng ở điều kiện 85°C trong 15 phút (Zerrin Yuksel và Yasar K Erdem, 2010; Tuba Sanli và cộng sự, 2011).
- Lên men:
Mục đ ch: Giúp đông tụ các protein của sữa do sự axit hóa, tạo mùi vị đặc trưng và cấu trúc cho sản phẩm.
26
độ 40 o
C trong 4-5 giờ đến khi đạt pH= 4,6, xác định thời gian và pH trong quá trình lên men.
- Làm lạnh:
Mục đ ch: Ổn định cấu trúc gel, làm chậm tốc độ sinh tổng hợp axit lactic của vi khuẩn Cách tiến hành: Làm lạnh m u đến 22±2 oC . Sau đó sản phẩm được bảo quản ở nhiệt độ 4±2o
C.
2.3 Nội dung nghiên cứu
Hình 2. 2: Sơ đồ nghiên cứu
2.3.1 Phân tích thành phần hóa học của sữa bột nguyên liệu
Các thành phần protein, chất béo, hàm lượng chất khơ của sữa bột, sữa hồn ngun được phân t ch theo mục 2.4
2.3.2 Đánh giá sự tƣơng quan giữa gelatin và MTGase trong sản phẩm yogurt 2.3.2.1 Xây dựng mơ hình thực nghiệm 2.3.2.1 Xây dựng mơ hình thực nghiệm 2.3.2.1 Xây dựng mơ hình thực nghiệm
Chúng tơi sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt (Respone Surface Method – RSM). Mục tiêu của phương pháp RSM là tối ưu hóa các phản ứng và nó đã được áp dụng rộng rãi cho các quá trình khác nhau trong thực phẩm (Tang, 2016).
Độ axit, độ pH.
Đánh giá cảm quan.
Xác định độ tách whey
Xác định độ lưu biến, FTIR
Hình ảnh chụp FeSem.
Phân tích protein, chất béo, hàm lượng chất khô.
Một tổ hợp gồm 13 thí nghiệm được bố tr như ở mục bảng 2.3.
Xác định: Độ tách whey(%), protein hòa tan(mg/ml).
Đánh giá sự tương quan giữa gelatin và MTGase trong sản phẩm yogurt
Đánh giá ảnh hưởng của Gelatin và MTGase đến đặc điểm hóa lý và cơ lý của sản phẩm yogurt.
Phân tích thành phần hóa học của sữa bột nguyên liệu
27
Bề mặt phản hồi có thể được biểu diễn bằng đồ thị, trong không gian ba chiều hoặc dưới dạng một biểu đồ đường giúp hình dung hình dạng của nó. Một thiết kế thử nghiệm thường được sử dụng trong RSM là thiết kế mơ hình lặp tâm (Central Composite Design- CCD) (Montgomery, 1997). CCD là một thiết kế rất hiệu quả để lắp bề mặt đáp ứng bậc hai, phương trình hồi quy thực nghiệm theo phương pháp quy hoạch trực giao cấp hai cấu trúc có tâm có dạng (Nguyễn Tấn Dũng và cộng sự, 2017):
Y= β0 + ∑ + ∑ + ∑ (2.2) Trong đó:
b0, bj, bjj là các hệ số của phương trình hồi quy; xj, xi là các biến mã hóa của các yếu tố cơng nghệ;
λ là hệ số đưa vào ma trận thí nghiệm để hình thành ma trận có t nh trực giao. Các hệ số bj, bjl, bjj được xác định như sau (Nguyễn Tấn Dũng và cộng sự, 2017):
bj = ∑
∑ ; bjl = ∑
∑ ; bjj = ∑
(2.3)
- Ý nghĩa của các hệ số hồi quy (theo tiêu chuẩn Student)
- Sự tương th ch của phương tình hồi quy với thực nghiệm (theo tiêu chuẩn Fisher). Các biến mã hóa (x1, x2) thu được quy đổi qua giá trị thực (Z1, Z2) theo công thức:
Zj = (xj*ΔZj) + (2.4)
Khối tròn tổng hợp trung tâm (Central Composite Circumscribed- CCC): trong thiết kế CCC ba yếu tố, các mức cao (+1) và thấp (-1) được thể hiện ở góc của khối lập phương. Các điểm sao (star points) được dịch chuyển ra bên ngồi khơng gian ở cùng khoảng cách từ tâm điểm bằng khoảng cách từ tâm đến các góc (Tang, 2016).
28
Hình 2. 3: Mơ phỏng mơ hình Central Composite Circumscribed (Tang, 2016).
Qua kết quả tổng quan tài liệu (Jihan Putra Ramdhani, 2018; Dr. Ashna T. Abdulqadr, 2015; Zhihua Pang, 2014; Supavititpatana, 2008;... ), và thực nghiệm sơ bộ được tiến hành chúng tôi chọn hai yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng yogurt đó là: hàm lượng MTGase -Z1(%, g/100ml sữa), hàm lượng gelatin -Z2 (%, g/100ml sữa). Mục tiêu đặt ra là: y1- Độ tách whey (%), y2- Hàm lượng protein trong whey (mg/ml whey). Các hàm mục tiêu cần đạt được là y1min và y2min. Các đối tượng công nghệ trong nghiên cứu được thể hiện ở hình 2.4.
Hình 2. 4: Đối tượng cơng nghệ sản xuất yogurt
Số thí nghiệm (N) được xác định theo công thức (Nguyễn Tấn Dũng và cộng sự, 2017): N= 2k + 2k + no (2.4) Hộp đen Z1 nồng độ MTGase (g/g protein) Z2 nồng độ gelatin (g) Y1- Độ tách whey (%) Y2- Hàm lượng protein trong whey (mg)
29
Trong đó: k là số yếu tố công nghệ ảnh hưởng đến hàm mục tiêu (k=2), n0 là số thí nghiệm tại tâm.
Với k=2, no= 5 thế vào công thức ta được:
N= 22 + 2*2 + 5= 13 (thí nghiệm)
Cánh tay địn (α) được xác định theo cơng thức (khi k<5) (Nguyễn Tấn Dũng và cộng sự, 2017):
α = = 21/2= 1,414 (2.5)
T nh quay đồng đều đạt được khi chọn hằng số không vượt quá đơn vị (Nguyễn Tấn Dũng và cộng sự, 2017):
=
=
= 0,40625 (2.6)
Trong đó: nk = 2k : số thí nghiệm của phương án thực nghiệm yếu tố từng phần n* = nα = 2k : số thí nghiệm của phương án thực nghiệm ở điểm (*), điểm của các cánh tay địn;
no: số thí nghiệm của phương án thực nghiệm ở tâm (0).
Các mức yếu tố được trình bày trong bảng 2.2, bố trí 13 thí nghiệm sẽ trình bày trong bảng 2.3 Bảng 2. 2: Các mức yếu tố ảnh hưởng Các yếu tố - α (-1,414) Mức dưới (-1) Mức tâm(0) Mức trên(+1) +α (+1,414) Khoảng biến thiên ΔZ Z1(MTG, g/ g protein sữa 0,004 0,021 0,062 0,103 0,12 0,041 Z2(Gelatin, g) 0,128 0,2 0,375 0,55 0,622 0,175
30
Bảng 2. 3: Ma trận quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 2
STT M u
Biến thực Biến mã hóa
Z1(MTG, g/g
protein sữa) Z2(gelatin, g) Z1 Z2
1 0,021 0.2 -1 -1 2 0,103 0.2 1 -1 3 0,021 0.55 -1 1 4 0,103 0.55 1 1 5 0,004 0.375 -1.414 0 6 0,120 0.375 1.414 0 7 0,062 0.128 0 -1.414 8 0,062 0.622 0 1.414 9 0,062 0.375 0 0 10 0,062 0.375 0 0 11 0,062 0.375 0 0 12 0,062 0.375 0 0 13 0,062 0.375 0 0
2.3.2.2 Kiểm định ý nghĩa các hệ số hồi quy
Ý nghĩa các hệ số hồi quy được kiểm định theo tiêu chuẩn Student. Tiêu chuẩn Student được xác định theo công thức (Nguyễn Tấn Dũng và cộng sự, 2017):
tj = | |
(2.7)
Trong đó: bj là hệ số thứ j trong phương trình hồi quy
Sbj là phương sai của hệ số thứ j được tính theo cơng thức sau (Nguyễn Tấn Dũng và cộng sự, 2017):
√
∑ ; √
∑ ; √
31
Trong đó: là phương sai tái hiện (sai số tái hiện của các thí nghiệm được lặp lại ở cùng một điều kiện), được tính theo cơng thức sau (Nguyễn Tấn Dũng và cộng sự, 2017):
∑ ̅
(2.9)
So sánh giá trị tj theo thực nghiệm với giá trị tb ở bảng tra phân vị phân bố Student (Nguyễn Tấn Dũng và cộng sự, 2017).
Nếu :
- tj < tb (f2) thì hệ số bj loại khỏi mơ hình tốn học.
- tj > tb (f2) thì hệ số được chấp nhận trong mơ hình tốn học.
2.3.2.3 Kiểm định tiêu chuẩn Fisher:
F =
(2.10)
Trong đó: là phương sai dư để xác định t nh tương th ch giữa giá trị thực nghiệm
thu được với giá trị tính theo lý thuyết. Phương sai dư được tính theo cơng thức sau (Nguyễn Tấn Dũng và cộng sự, 2017):
= ∑ ̂ (2.11)
Nếu F < F1-p(f1,f2) thì phương trình hồi quy tương th ch với mơ hình thực nghiệm, ngược lại thì khơng tương th ch, phải chọn lại mơ hình trực giao thực nghiệm khác thích hợp.
Ý nghĩa của các hệ số và t nh tương th ch của phương trình hồi quy được kiểm định lại bằng phần mềm Design Expert. Mơ hình và phương trình hồi qui được kiểm tra mức độ phù hợp với thực nghiệm bằng kiểm định Fisher của mơ hình (với giá trị = 0,05) và sự thiếu phù hợp (Lack of fit). Nếu giá trị Pvalue nhỏ hơn giá trị α và càng nhỏ thì mơ hình càng phù hợp. Hệ số “Lack of fit” phải lớn hơn giá trị α (lớn hơn 0,05) thì mơ hình đó mới phù hợp, giá trị “Lack of fit” càng lớn thì mức độ phù hợp của mơ hình càng tăng.
2.3.2.4 Giải bài tốn tối ƣu đơn mục tiêu
Bài toán tối ưu đơn mục tiêu được lập dựa trên phương trình hồi quy xác định bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm là hàm mô tả sự phụ thuộc của các yếu tố khảo sát sự bổ sung gelatin và MTGase trong yogurt. Điều kiện ràng buộc là giới hạn của vùng nghiên cứu. Phần mềm Design–Expert được sử dụng để mơ hình hóa thí nghiệm theo phương pháp đáp
32
ứng mơ hình bề mặt RSM, phân tích các kết quả thực nghiệm theo mơ hình và giải bài tốn tối ưu đơn mục tiêu. Cuối cùng, thực hiện việc phân tích tại điểm tối ưu với các điều kiện khảo sát và so sánh với kết quả dự đoán để kiểm tra sự chính xác của mơ hình dự đốn (thực nghiệm kiểm chứng).
2.3.3 Đánh giá ảnh hƣởng của Gelatin và MTGase đến đặc điểm hóa lý và cơ lý của sản phẩm yogurt phẩm yogurt phẩm yogurt
Mục đ ch: Xác định các chỉ tiêu để đánh giá chất lượng các m u yogurt.
Cách tiến hành: Ba m u đối chứng ĐC 1, ĐC 2, ĐC 3 tương ứng lần lượt là m u yogurt bổ sung MTGase, bổ sung gelatin và không bổ sung MTGase và gelatin,cùng với đó là 6 m u được chọn từ phương pháp đáp ứng bề mặt được xác định các chỉ tiêu độ tách whey, độ axit, độ pH, Đánh giá cảm quan, , xác định độ lưu biến, Phổ hồng ngoại- FTIR, hình ảnh chụp FeSem tiến hành theo mục 2.4.
2.4 Phƣơng pháp phân tích 2.4.1 Độ tách whey 2.4.1 Độ tách whey
Mục đ ch: Độ tách whey giúp xác định khả năng giữ nước của các m u yogurt.
Cách tiến hành: Cân chính xác khối lượng m u yogurt đến 0.1mg. Ly tâm ở 3500 vòng/ phút trong 15 phút. Sau đó, cân khối lượng whey ly tâm được và tính tốn theo cơng thức (Aprodu, 2011):
%Whey =
100 (2.12)
2.4.2 Xác định protein hòa tan
Chúng tơi xác định protein hóa tan bằng phản ứng Folin theo phương pháp Lowry (Lowry, 1951). Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để ước t nh lượng protein (đã có trong dung dịch hoặc dễ tan trong kiềm lỗng).
Nguyên tắc: Đầu tiên là protein được xử lý trước bằng ion đồng trong dung dịch alkalli sau đó các axit amin thơm trong m u được xử lý khử axit photphomolybdatephosphotungstic có trong thuốc thử Folin. Sản phẩm cuối cùng của phản ứng này có màu xanh lam. Lượng protein trong m u có thể được ước tính thơng qua việc đọc độ hấp thụ (ở bước sóng 750nm) của sản phẩm cuối cùng của phản ứng Folin so với đường chuẩn của dung dịch protein chuẩn đã chọn (trong trường hợp của chúng tôi là dung dịch Albumin Egg).
33
1. Pha dung dịch A, B, C theo công thức như sau:
A: 2,8598g NaOH + 14,3084g Na2CO3 định mức lên 500ml. B: 1,4232g CuSO4.5H2O định mức lên 100ml
C: 2,85299g Na2.Tartrate.2H2O định mức lên 100ml Sau đó trộn A:B:C (dung dịch Lowry) theo tỉ lệ 100:1:1
2. Pha 5ml Folin 2N với 6ml H2O ( pha mới trước khi ủ trong bình tối). 3. Pha dung dịch chuẩn
Cân 0,005g Albumin Egg định mức lên 10ml ta sẽ được dung dịch có nồng độ 500µg/ml.
Đưa vào ống nghiệm 15ml theo công thức sau:
Albumin(ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
H2O(ml) 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4
Dung dịch Lowry(ml)
1,4 1,4 1,4 1,4 1,4 1,4 1,4
Đậy nắp lại và lắc nhanh, sau đó ủ tối ở nhiệt độ phịng trong 20 phút.
4. Chuẩn bị dung dịch Folin ở mục 2, cho vào mỗi ống nghiệm 0,2ml dung dịch Folin mới pha. Đậy nắp lại và trộn nhanh sau đó ủ tối trong thời gian tối thiếu 30 phút ở nhiệt độ phòng.
5. Mở Uv-Vis làm ấm máy trước khi đo. Sau 30 phút lắc nhanh m u lần nữa và cho vào cuvet thủy tinh để đo.
2.4.3 Độ axit
Nồng độ axit lactic được tạo ra từ nuôi cấy trong yogurt được đo bằng phương pháp axit chuẩn độ theo tiêu chuẩn của Törner.
Cách tiến hành:
Trộn kỹ m u bằng thìa, hoặc sử dụng máy đồng hóa nhằm đảm bảo tính chính xác khi lấy m u. Cân khoảng 10 g m u vào cốc 50 ml, thêm khoảng 10 mL nước và trộn. Chuẩn độ sản phẩm trong cốc thủy tinh, được thực hiện bằng cách sử dụng NaOH 0,1 M với sự có mặt của 0,5 ml dung dịch ethanol phenolphtalein 1% làm chất chỉ thị cho điểm cuối của màu hồng nhạt. Ghi lại kết quả NaOH chuẩn độ được và tính tốn theo công thức (Katya Dimitrova, 2015):
34
o
T= V*10 (2.12)
Trong đó: V là ml NaOH thu được
2.4.4 Phân tích các đặc điểm lƣu biến học
Các đặc t nh lưu biến học được nghiên cứu bằng máy đo lưu biến Rheostress Drehkorper/ Rotor (Đức).
Mục đ ch: Xác định bản chất chất lỏng của các m u yogurt, đồng thời so sánh các đặc t nh lưu biến học của các sản phẩm này.