Chương 1 : TỔNG QUAN
1.3. Tổng quan về DNA thai tự do trong máu thai phụ
1.3.5. Các phương pháp tiếp cận tin sinh học xác định nồng độ cffDNA
Việc phát hiện cffDNA đã tạo ra một sự thay đổi lớn trong sàng lọc
trước sinh không xâm lấn (NIPS). Hiện nay, một loạt các phương pháp tiếp cận xét nghiệm NIPS sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) đã được phát triển nhanh chóng trong y học lâm sàng, trong đó nồng độ cffDNA là một thông số quan trọng để đảm bảo độ chính xác cho kết quả xét nghiệm. Nếu có
đủ nồng độ cffDNA trong mẫu và trong các giai đoạn kiểm sốt chất lượng xét nghiệm, thì xét nghiệm có thể cung cấp số đếm chính xác của các đoạn
đọc DNA. Nồng độ cffDNA càng lớn, càng có khả năng phân biệt thai bình
thường với thai lệch bội NST, đặc biệt là trisomy 21 [47]. Ngưỡng nồng độ
Hiện nay, có nhiều thuật tốn khác nhau được sử dụng để tính tốn nồng
độ cffDNA, các mơ hình thuật tốn tính nồng độ cffDNA phụ thuộc vào
phương pháp tiếp cận của từng mơ hình (hình 1.9). Trong các nghiên cứu ban
đầu, các chỉ thị di truyền nằm trên NST Y được thừa hưởng từ người cha, như gen SRY, DYS14 và ZFY. Các marker này được sử dụng đểxác định nồng độ
cffDNA dựa trên kỹ thuật PCR [51]. Ví dụ, tỷ lệ của nồng độ các trình tự từ
NST Y với nồng độ các trình tự từ một NST mục tiêu được sử dụng để xác
định tỷ lệ cffDNA. Xét nghiệm NIPS sử dụng phương pháp giải trình tự song song số lượng lớn các đoạn DNA ngắn (MPS), tỷ lệ các trình tự đọc từ NST Y có thể được coi là tỷ lệ cffDNA. Mặc dù những phương pháp này rất đơn
giản và chính xác nhưng chỉ áp dụng cho những thai phụ mang thai nam [51].
Phương pháp dựa vào sự khác biệt đa hình đơn nucleotide (single nucleotide
polymorphism - SNP) giữa DNA tự do của mẹ và thai. Hạn chế của phương
pháp này là yêu cầu độ bao phủ khoảng 120x bằng giải trình tự đích để xác
định alen của thai nhi, vì vậy giá thành của xét nghiệm tăng lên rất cao [52].
Phương pháp dựa trên kích thước DNA tự do, DNA thai ngắn hơn DNA mẹ.
Sử dụng giải trình tự hai chiều (paired-end sequencing) để xác định trình tự
của đoạn DNA. Phương pháp có độ chính xác khơng cao và chi phí cao do giải trình tự hai chiều [38]. Phương pháp dựa trên sự khác biệt về đặc điểm methyl hóa giữa DNA thai và DNA mẹ để ước tính nồng độ cffDNA (methyl hóa DNA là q trình gắn nhóm methyl vào nucleotide cytosine). Phương pháp địi hỏi xử lý các gốc CpG và giải trình tự toàn bộ bộ gen đã bisulfite
gây tốn kém và không thể áp dụng cho xét nghiệm thường quy [53]. Gần đây, phương pháp đếm số lượng đoạn đọc (SeqFF) đã được phát triển, nhằm tính tốn trực tiếp nồng độ cffDNA từ dữ liệu thường quy mà không cần thêm
thông tin nào. Trong phương pháp này, sử dụng giải trình tự ngẫu nhiên một chiều (single-end random sequencing), Phương pháp SeqFF sử dụng mơ hình hồi quy đa biến bao gồm 2 mơ hình hồi quy (mạng lưới đàn hồi
(elastic net) và tiêu chuẩn chọn lựa thứ hạng (weighted rank selection criterion, WRSC)) nhằm ước tính nồng độ cffDNA. Đầu tiên, bộ gen được chia thành nhiều vùng (bin), mỗi vùng có kích thước 50kb, sau đó sử dụng mơ hình hồi quy tuyến tính (weighted linear regression model) kết hợp đếm các
đoạn đọc DNA trên tất cả các vùng của NST thường để dự đoán số lượng đoạn
đọc cho NST Y (trong mơ hình mạng lưới đàn hồi) hoặc số lượng đoạn đọc DNA cho từng vùng riêng biệt trên NST Y (mơ hình WRSC). Nồng độ cffDNA được ước tính là trung bình của hai mơ hình. Phương pháp SeqFF có thể áp dụng cho cả thai phụ mang thai nữ [46].
Hình 1.9. Các cách tiếp cận để xác định nồng độ cffDNA