2.2.4.3. Đánh giá giá trị của phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới sử dụng DNA thai tự do trong máu mẹ.
- Sử dụng xét nghiệm NST đồ (karyotype) phân tích bộ NST từ dịch ối để đánh giá giá trị của phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới. NST được phân tích theo hệ thống danh pháp quốc tế về di truyền người ISCN 2016 (An
International System for Human Cytogenetic Nomenclature) [90]:
+ Phân tích trên kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần. Các cụm NST
đủ tiêu chuẩn phân tích là những cụm có NST phân tán tốt, khơng chồng lên nhau, cịn nền bào tương, kích thước NST không quá ngắn, băng rõ.
+ Các cụm NST được phân tích về số lượng và cấu trúc, đánh giá NST bình thường hay đột biến:
Đột biến sốlượng: Khi cụm phân tích có nhiều hoặc ít hơn 46 NST. Đột biến cấu trúc: Đảo đoạn, chuyển đoạn, nhân đoạn, mất đoạn, NST vòng, NST hai tâm…
Mỗi mẫu được phân tích 30 cụm NST ở kỳ giữa và lập karyotype ≥ 5 cụm. Những trường hợp khảm, phân tích 100 cụm NST.
- Đánh giá giá trị của của phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới bằng các thông số: Độ nhạy (Se - Sensitivity) hay tỷ lệ phát hiện (detection rate - DR),
độ đặc hiệu (Sp - Specificity), giá trị tiên đốn dương tính (PPV - Positive predictive value) và giá trịtiên đốn âm tính (NPV - Negative predictive value).
2.2.5. Quy trình nghiên cứu
- Thai phụ có chỉ định làm xét nghiệm NIPS sẽ được phỏng vấn để thu thập thông tin về đặc điểm cá nhân, tiền sử phụ khoa và tiền sử mắc các bệnh trong tiêu chuẩn loại trừ đã nêu ở trên.
- Thu thập các thông tin xét nghiệm sàng lọc trước sinh kết hợp thai kỳ
1 (CFTS), triple test và siêu âm hình thái, phân loại nhóm thai phụ về đặc
điểm ngưỡng nguy cơ sàng lọc, đặc điểm siêu âm hình thái (phụ lục 5).
- Thu thập 10mL mẫu máu toàn phần thai phụ vào ống chuyên dụng Streck BCTs và bảo quản mẫu ở nhiệt độ phòng, tối đa trong vòng 14 ngày (phụ lục 1). Tách huyết tương, sau đó tách DNA tự do từ mẫu máu toàn phần. DNA tự do sẽ được tạo thư viện, chuẩn bị mẫu thư viện, sau đó giải trình tự
trên hệ thống giải trình tự gen thế hệ mới Ion Torrent để xác định nguy cơ
lệch bội NST 13, 18, 21 và NST giới tính cụ thể như sau: + Quy trình lấy mẫu máu thai phụ (phụ lục 1).
+ Quy trình tách huyết tương. Mẫu huyết tương sau khi tách có thể lưu
trong vòng 6 tháng tại -80oC (phụ lục 2.1).
+ Quy trình tách DNA tự do bằng máy tách DNA tự động sử dụng hóa chất tách DNA tự do trong huyết tương (phụ lục 2.2).
+ Quy trình đo nồng độ DNA tự do bằng máy quang phổ phân tích chuỗi DNA kép và hóa chất đo nồng độ DNA (phụ lục 2.3).
+ Quy trình tạo thư viện sử dụng hóa chất Ion Plus Fragment Library (phụ lục 2.4) gồm 5 bước chính:
- Sửa đi và tinh sạch DNA tự do.
- Nối các đoạn Adapters và tinh sạch DNA tự do đã được nối. - Nhân bản và tinh sạch DNA thư viện tự do.
- Đo nồng độ DNA thư viện tự do - Kiểm tra chất lượng DNA thư viện.
- Định lượng DNA thư viện và tạo hỗn hợp DNA đồng nồng độ: Pha loãng các DNA thư viện đã được gẵn mã vạch xuống 55pM để đưa mẫu vào máy chuẩn bị mẫu Ion Cheft.