Chương 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.5. Quy trình nghiên cứu
- Thai phụ có chỉ định làm xét nghiệm NIPS sẽ được phỏng vấn để thu thập thông tin về đặc điểm cá nhân, tiền sử phụ khoa và tiền sử mắc các bệnh trong tiêu chuẩn loại trừ đã nêu ở trên.
- Thu thập các thông tin xét nghiệm sàng lọc trước sinh kết hợp thai kỳ
1 (CFTS), triple test và siêu âm hình thái, phân loại nhóm thai phụ về đặc
điểm ngưỡng nguy cơ sàng lọc, đặc điểm siêu âm hình thái (phụ lục 5).
- Thu thập 10mL mẫu máu toàn phần thai phụ vào ống chuyên dụng Streck BCTs và bảo quản mẫu ở nhiệt độ phòng, tối đa trong vòng 14 ngày (phụ lục 1). Tách huyết tương, sau đó tách DNA tự do từ mẫu máu toàn phần. DNA tự do sẽ được tạo thư viện, chuẩn bị mẫu thư viện, sau đó giải trình tự
trên hệ thống giải trình tự gen thế hệ mới Ion Torrent để xác định nguy cơ
lệch bội NST 13, 18, 21 và NST giới tính cụ thể như sau: + Quy trình lấy mẫu máu thai phụ (phụ lục 1).
+ Quy trình tách huyết tương. Mẫu huyết tương sau khi tách có thể lưu
trong vịng 6 tháng tại -80oC (phụ lục 2.1).
+ Quy trình tách DNA tự do bằng máy tách DNA tự động sử dụng hóa chất tách DNA tự do trong huyết tương (phụ lục 2.2).
+ Quy trình đo nồng độ DNA tự do bằng máy quang phổ phân tích chuỗi DNA kép và hóa chất đo nồng độ DNA (phụ lục 2.3).
+ Quy trình tạo thư viện sử dụng hóa chất Ion Plus Fragment Library (phụ lục 2.4) gồm 5 bước chính:
- Sửa đi và tinh sạch DNA tự do.
- Nối các đoạn Adapters và tinh sạch DNA tự do đã được nối. - Nhân bản và tinh sạch DNA thư viện tự do.
- Đo nồng độ DNA thư viện tự do - Kiểm tra chất lượng DNA thư viện.
- Định lượng DNA thư viện và tạo hỗn hợp DNA đồng nồng độ: Pha loãng các DNA thư viện đã được gẵn mã vạch xuống 55pM để đưa mẫu vào máy chuẩn bị mẫu Ion Cheft.
+ Quy trình chuẩn bị mẫu DNA thư viện trên máy Ion Chef (phụ lục 2.5.1)
Hình 2.3. Các bước chính chuẩn bị mẫu DNA thư viện trên Ion Chef + Giải trình tự trên máy Proton (phụ lục 2.5.2). + Giải trình tự trên máy Proton (phụ lục 2.5.2).
+ Phân tích kết quả: Sử dụng thuật toán dựa trên phương pháp đếm SeqFF của YOUNGENE ứng dụng tích hợp trong phần mềm tin sinh học phân tích tự động để tính tốn nồng độ cffDNA trên mỗi mẫu và điểm z-score cho từng NST.
+ Chẩn đoán xác định đối với thai phụ có kết quả xét nghiệm NIPS
dương tính: Chỉ định thủ thuật hút dịch ối khi thai phụ mang thai ≥ 16 tuần thai, ni cấy tế bào, lập karyotype phân tích bộ NST thai được thực hiện theo chuẩn băng G như là một tiêu chuẩn vàng để đối chứng với phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới (phụ lục 3 - 4).
+ Theo dõi thai đối với thai phụ kết quả xét nghiệm NIPS âm tính:
Theo dõi thai cho đến khi sinh tại Bệnh viện Phụ sản Hà Nội, trẻ sơ sinh sẽ được khám ngay sau sinh bởi bác sỹ sơ sinh và theo dõi tình trạng của trẻ