VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT
2.2.3.2. Phƣơng pháp tách chiết, tinh sạch DNA và RNA
Quy trình tách chiết DNA tổng số: Cân 200 mg mẫu và nghiền trong nitơ lỏng bằng
cối chày sứ cho đến khi thành dạng bột mịn.
Bảng 2.3. Thành phần dung dịch đệm tách chiết DNA tổng số
STT Nồng độ chuẩn Nồng độ cuối cùng 1 Tris - HCl 1 M, pH = 8,0 0,1 M 2 NaCl 5 M 1,4 M 3 EDTA 0,5 M 0,02 M 4 CTAB 4% 5 H2O khử ion
Bổ sung thêm 700 µl dung dịch đệm tách chiết DNA và đảo ngược nhẹ. Ủ ở nhiệt độ 650C khoảng 1 giờ (cứ 5 phút đảo nhẹ một lần). Thêm 600 µl dung dịch chloroform: isoamyl (24: 1) và đảo đều, để 5 phút ở nhiệt độ phòng.
Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 v/p, ở 4oC trong 10 phút. Dùng pipet hút lấy 500µl dịch sang ống eppendorf 1,5 ml.
Bổ sung 500 µl isopropanol lạnh, ủ hỗn hợp trong đá 30 phút. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 v/p ở 4oC, trong 10 phút.
Thu tủa DNA, rửa tủa bằng cồn 70% (1 lần). Ly tâm 13000 v/p ở 4oC, trong 10 phút, thu tủa và làm khô DNA.
Thêm 30 µl nước khử ion và 2µl RNAse, ủ ở 370
C trong 30 phút. Bảo quản DNA tổng số ở -200C.
Phương pháp tách chiết RNA tổng số:
Nghiền 100 mg lá trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ thành dạng bột mịn. Bổ sung 1ml Trizon, đảo nhẹ trong 15 phút.
Bổ sung 500 µl chloroform/isoamyl (24:1) để 5 phút ở nhiệt độ phòng.
Ly tâm 8000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Hút 500 µl dịch nổi sang ống 1,5 ml. Bổ sung 500 µl isopropanol sau đó đảo nhẹ nhàng. Để -200C trong 10 phút.
Ly tâm 8000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, thu phần tủa.
Rửa bằng cồn 70% pha DEPC, ly tâm 7000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Làm khô tủa. Bổ sung 30 µl H2O - DEPC. Bảo quản RNA tổng số ở -800C.