H nh 3.21 Kết quả điện di protein sau khi lai Western blot
3.4.1.1.Mơ sẹo hóa và tạo phôi soma
Nhiều nghiên cứu cho thấy, khả năng tạo cụm phôi soma từ phần phôi trục đều chịu ảnh hưởng lớn của nồng độ 2,4D, thời gian tạo phôi soma kéo dài (khoảng 7 tuần) [12], [22], [25], [35], [70].
Chúng tôi lựa chọn giống lạc L12 trong nhóm chịu hạn tốt, L20 thuộc nhóm chịu hạn khá và giống LVT thuộc nhóm chịu hạn kém phục vụ cho nghiên cứu này. L12 là giống lạc sinh trưởng, phát triển rất tốt trong điều kiện nuôi cấy in vitro. Khả năng tạo mô sẹo, tạo đa phôi và tái sinh cây thu được kết quả với tỷ lệ cao. Đây cịn là giống có năng suất cao và được trồng phổ biến tại các địa phương. Nhằm cải tạo tính chống chịu của cây lạc với điều kiện bất lợi của môi trường chúng tôi chọn giống lạc chịu hạn kém LVT để thử nghiệm tạo đa phôi và chuyển gen chỉ thị GUS.
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D đến sự hình thành phơi soma được thể hiện ở bảng 3.10.
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D đến sự hình thành phơi soma
Sau một tuần nuôi tối, phôi trục cảm ứng tạo thành một khối mơ sẹo có kích thước khoảng 3x3x3 mm, màu vàng hơi xanh, không nhớt hoặc trắng xốp. Sau 7 tuần ni ngồi sáng chỉ các khối mô sẹo màu vàng, khơng nhớt mới có khả năng tạo cụm phôi soma. Các phôi màu trắng xốp hoặc nâu đen chỉ phân hóa thành khối mơ sẹo nhớt, kích thước tăng dần theo thời gian ni cấy.
Ở nồng độ 2,4D 20 mg/l, tỷ lệ tạo phôi soma cao nhất (97,82%) ở giống lạc L12, thấp nhất (82,25%) ở giống lạc LVT. Tỷ lệ này giảm xuống khi nồng độ 2,4-D thấp hoặc cao hơn mức này. Kết quả thí nghiệm của chúng tôi thu được tương tự như đánh giá của Baker và Wetzstein (2002), nồng độ 2,4-D 20mg/l cho khả năng tạo phôi soma cao hơn so với nồng độ 2,4-D 40mg/l [25]. Bùi Văn Thắng và cộng
sự (2005) nghiên cứu khả năng tạo phôi soma của giống lạc MD7 dưới ảnh hưởng của các nồng độ 2,4-D khác nhau thấy rằng, tỷ lệ tạo phôi soma cao nhất đạt 95,8% ở nồng độ 20mg/l [12]. Theo Little và đtg (2000), Akins và đtg (2002), kiểu gen của từng giống lạc phản ứng khác nhau với khả năng tạo phôi soma [22], [70].
2,4-D (mg/l) (mg/l)
Tỷ lệ mô sẹo tạo phôi soma (%) (n=30)
L12 L20 LVT
6 62,41 ± 1,02 36,76 ± 1,84 34,67 ± 1,02 10 86,73 ± 1,19 54,47 ± 1,07 48,97 ± 1,09 10 86,73 ± 1,19 54,47 ± 1,07 48,97 ± 1,09 20 97,82 ± 1,98 88,45 ± 1,68 82,25 ± 1,66 30 75,72 ± 2,02 55,34 ± 1,56 56,64 ± 0,96
Số phôi soma/Phôi nuôi cấy
6 6,55 ± 0,85 3,36 ± 0,74 3,45 ± 0,45 10 9,86 ± 0,38 5,43 ± 0,46 6,54 ± 0,23 10 9,86 ± 0,38 5,43 ± 0,46 6,54 ± 0,23 20 14,94 ± 1,02 8,56 ± 0,79 9,54 ± 0,18 30 4,75 ± 0,93 4,34 ± 0,48 4,23 ± 0,12
Số phơi soma trung bình thu được cao nhất là 14,94 phôi (2,4-D 20mg/l) trên một phôi trục ban đầu và thấp nhất là 4,75 (2,4-D 30mg/l) ở giống lạc L12. Cao nhất 9,54 phôi và thấp nhất là 3,45 phôi (30mg/l 2,4-D) ở giống lạc LVT. Ở giống L20 số phơi soma trung bình thu được cao nhất là 8,56 phôi, thấp nhất là 3,36 phơi. Phơi soma có nhiều hình dạng khác nhau, nhưng đa số có hình trụ và nhiều phơi đính chung ở phần rễ mầm.
Có thể thấy, nồng độ 2,4-D 20mg/l là nồng độ kích thích sinh trưởng phù hợp trong nghiên cứu của chúng tôi nhằm tạo phôi soma từ phôi trục hạt lạc thông qua q trình mơ sẹo hóa.
Q trình tái sinh theo con đường sử dụng nguồn mẫu ban đầu trải qua q trình mơ sẹo hóa đã được đề cập đến trong nhiều nghiên cứu trên đối tượng cây lạc
[11], [12], [14], [35]. Các mẫu vật được sử dụng có thể có nguồn gốc từ các phần
mô khác nhau trên cơ thể thực vật như phôi trục, lá non, đoạn thân...Sau khi mẫu cấy được xử lý và đưa lên môi trường tạo mơ sẹo thích hợp, thường là chứa chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin (2,4D) với thời gian ni cấy nhất định sẽ tạo khối mô sẹo.