M: marker 1kb; 1-9: Các dòng chuyển gen; (-) Đối chứng âm; (+) Đối chứng dương
A B C
D E F
Các dòng thuốc lá sau một khoảng thời gian nhất định sống sót ngồi tự nhiên đã được chúng tôi kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu
NAC2XbaI/NAC2SacI. Kết quả ở hình 3.18 cho thấy, trong số 9 dòng thuốc lá sàng
lọc ngẫu nhiên sau kiểm tra đều cho phản ứng dương tính, các giếng điện di xuất hiện băng DNA đặc hiệu có kích thước khoảng 1,1kb.
Các dịng cây thuốc lá chuyển gen cho kết quả dương tính ban đầu với phản ứng PCR được trồng và tiếp tục theo dõi nhằm có những phân tích tiếp theo về khả năng biểu hiện của gen chuyển.
3.3.3. Đánh giá các dòng thuốc lá chuyển gen mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 mã NAC2
Phân tích chức năng sinh học của gen chu ển
Các dòng thuốc lá chuyển gen sau khi sàng lọc và cho kết quả dương tính với phản ứng PCR được chúng tôi tiến hành thí nghiệm gây hạn nhân tạo bằng cách ngừng tưới nước. Hàm lượng proline là một chỉ tiêu được phân tích trong đánh giá cây thuốc lá chuyển gen. Proline đóng vai trị quan trọng đối với khả năng chống chịu hạn ở thực vật. Khi gặp điều kiện khô hạn, proline sẽ được tổng hợp tăng trong tế bào.
Mẫu lá của các dòng thuốc lá chuyển gen và đối chứng được chúng tôi thu ở thời điểm trước khi gây hạn và sau khi gây hạn 3, 5, 7 và 9 ngày. Kết quả phân tích hàm lượng proline được chỉ ra trong bảng 3.9 và hình 3.20.
Bảng 3.9. Hàm lượng proline trong các dòng thuốc lá nghiên cứu (mg/ml)
Dòng TH 3 ngày hạn 5 ngày hạn 7 ngày hạn 9 ngày hạn Tỷ lệ tăng
so TH (%) ĐC 0,14 ± 0,02 0,19 ± 0,04 0,22 ± 0,03 0,26 ± 0,08 0,28 ± 0,07 200,00 T0.16 0,26 ± 0,04 0,69 ± 0,11 0,81 ± 0,09 1,02 ± 0,18 1,16 ± 0,21 446,15 T0.19 0,22 ± 0,01 0,59 ± 0,08 0,71 ± 0,12 0,89 ± 0,15 1,02 ± 0,19 463,63 T0.28 0,27 ± 0,05 0,65 ± 0,08 0,76 ± 0,11 0,81 ± 0,13 0,93 ± 0,14 344,44 T0.36 0,27 ± 0,09 0,55 ± 0,10 0,68 ± 0,07 0,81 ± 0,09 0,99 ± 0,10 366,67 T0.48 0,22 ± 0,02 0,54 ± 0,11 0,63 ± 0,05 0,72 ± 0,11 0,84 ± 0,16 381,82 T0.56 0,25 ± 0,05 0,52 ± 0,07 0,68 ± 0,10 0,79 ± 0,14 0,91 ± 0,11 364,00
Hình 3.20. Các dịng cây thuốc lá sau 2 tuần gây hạn nhân tạo
A. Các dòng cây thuốc lá chuyển gen; B. Các dòng cây thuốc lá đối chứng. Các dòng cây xử lý đều đã bị héo lá sau thời gian thiếu nước dài ngày, tốc độ sinh trưởng chậm. Dòng cây đối chứng xuất hiện nhiều lá vàng, úa. Các dòng thuốc lá chuyển gen có các mức độ chống chịu và hàm lượng proline khác nhau, điều này có thể do khả năng biểu hiện của gen biến nạp và phụ thuộc vào vị trí chèn trong hệ gen vật chủ hoặc số lượng copy của gen biến nạp.
Biến nạp gen với mục đích cuối cùng là đưa được tính trạng mong muốn vào cây trồng. Vì vậy, khâu phân tích trực tiếp tính trạng là khâu có giá trị quyết định. Các nhà nghiên cứu kiểm tra, phân tích tính chống chịu bằng thí nghiệm gây điều kiện ngoại cảnh bất lợi nhân tạo. Đối với khơ hạn có nhiều cách bố trí thí nghiệm khác nhau: Xử lý hạn bằng PEG hay đường sucrose, các chất này cạnh tranh nước với bộ rễ của cây; Bố trí thí nghiệm gây hạn nhân tạo trong nhà hoặc buồng trồng cây bằng cách không tưới nước hoặc tưới phục hồi rất hạn chế. Các thí nghiệm được tiến hành với cây trồng trên cát sạch hoặc đất trồng cây [1].
Theo nhiều tác giả, tính chống chịu với các điều kiện bất lợi của cây trồng có mối tương quan thuận với sự gia tăng hàm lượng proline. Proline được tích lũy
A
trong cây khi gặp điều kiện bất lợi. Nồng độ proline khác nhau ở các lồi và khi gặp hạn có thể tăng gấp 100 lần so với mức bình thường. Proline như tín hiệu phản ứng của cây trồng đối với các yếu tố cực đoan của môi trường [3], [7].
Nhiều kết quả thí nghiệm cho thấy, với những giống có khả năng chống chịu kém thì có hàm lượng proline tổng số của các mẫu sau xử lý hạn thấp hơn, có mối tương quan giữa hàm lượng proline và tính chống hạn ở cây trồng, proline có thể xem là một chỉ tiêu để đánh giá tính chịu hạn [3].
Đánh giá sự có mặt của protein do gen chu ển tạo ra
Cùng với việc phân tích tính chống chịu bằng thí nghiệm gây điều kiện ngoại cảnh bất lợi nhân tạo nhằm đánh giá cây trồng sau chuyển gen, chúng tôi tiến hành kỹ thuật lai Western với mong muốn kiểm tra sự có mặt của protein do gen chuyển tạo ra.
Biểu hiện gen được xem là qúa trình hoạt động của gen để tạo ra sản phẩm cuối cùng là protein. Bước dịch mã từ mRNA thông qua ribosome, phân tử polypeptide được tổng hợp với trình tự amino acid chính xác do trình tự nucleotit trong đoạn DNA mã hóa của gen quyết định. Để đánh giá sự có mặt của protein do gen chuyển có thể tiến hành kỹ thuật lai Western [1].
Dựa trên nguyên lý của phản ứng miễn dịch giữa kháng nguyên (là sản phẩm protein do gen NAC2 mã hóa) và kháng thể đặc hiệu đối với kháng nguyên đó.
Trước hết protein toàn phần được tách chiết từ mẫu thuốc lá chuyển gen, điện di trên gel polyacrylamid, thấm truyền lên màng nitrocellulose rồi lai với kháng thể. Quá trình hiển thị sản phẩm lai thực hiện thông qua phản ứng tạo màu với phosphatase kiềm.
Gen NAC2/c-myc/KDEL có kích thước khoảng 1,1kb, sau khi dịch mã, phân tử protein sẽ có kích thước tính tốn theo lý thuyết khoảng 39 kDa. Kết quả lai Western cho thấy, ở 2 dòng thuốc lá chuyển gen N19 và N106 xuất hiện tín hiệu lai có khối lượng phân tử vào khoảng 39 kDa, dòng cây khơng chuyển gen khơng có tín hiệu lai (Hình 3.21). Kết quả thí nghiệm khẳng định, protein do gen NAC2 mã
hóa đã biểu hiện trong 2 dòng thuốc lá chuyển gen và cấu trúc đã thiết kế hoạt động tốt ở thuốc lá.