VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT
2.2.2.2. Tái sinh cây lạc phục vụ chuyển gen
Phương pháp tái sinh cây qua mơ sẹo hóa và phơi soma được tiến hành dựa trên phương pháp của một số tác giả đã công bố [12], [22], [25], [35], [70].
Thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Các thí nghiệm được thực hiện trong phịng ni cấy với điều kiện chiếu sáng theo quang chu kì 16 giờ sáng và 8 giờ tối, nhiệt độ phòng 250C ± 2, cường độ chiếu sáng 2000 lux.
Tạo nguyên liệu nuôi cấy in vitro
Khử trùng hạt
Củ lạc sau khi phơi khô, thu lấy hạt. Hạt lạc được khử trùng bằng cồn 70% trong thời gian 1 phút, javen 60% lắc đều trong 15 - 20 phút, sau đó rửa sạch bằng nước cất khử trùng 3 đến 4 lần.
Tạo mô sẹo đa phôi
Hạt lạc đã khử trùng đặt lên giấy thấm vô trùng, tách lấy phôi trục khỏi 2 lá mầm. Cấy phôi lạc lên môi trường MS cơ bản, bổ sung 2,4-D (6 - 30mg/l), saccharose 3%, agar 0,8%, pH từ 5,8- 6,0. Số lượng 20 phơi/bình tam giác. Ni cấy mô sẹo trong tối một tuần, sau đó đưa ra ngồi sáng tại phịng ni cấy với cường độ chiếu sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10/24h, nhiệt độ 25ºC - 7 tuần.
Tái sinh cây
Cụm phôi soma sau 8 tuần nuôi cấy được chuyển sang môi trường tái sinh cây SIM1. Sau 3-4 tuần, chuyển các mẫu tạo chồi lên môi trường tạo chồi SIM2 nhằm kéo dài chồi.
Tạo cây hoàn chỉnh
Chồi đạt chiều cao từ 3-4 cm trở lên được chuyển sang mơi trường ra rễ. Cây T0 hồn chỉnh được trồng trên giá thể với thành phần trấu:cát (1:1) trong 2 tuần, sau đó chuyển ra bầu 40% đất, 30% trấu hun hoặc mùn mục và 30% cát sạch được trộn đều và chăm sóc trong điều kiện tự nhiên.