c. Tách chiết plasmid tái tổ hợp
2.2.3 Các phƣơng pháp phân tích cây chuyển gen Phân tích biểu hiện gen gus bằng nhuộm hóa mô tế bào
Phân tích biểu hiện gen gus bằng nhuộm hóa mơ tế bào
Với gen GUS được kiểm tra bằng phương pháp nhuộm của Jefferson và đtg
(1987) [58]. Mẫu phôi soma hoặc cây tái sinh hoàn chỉnh được ngâm trong dung dịch X-gluc (50mM Na2HPO4 và NaH2PO4; pH = 7,0; 10 mM K3[Fe(CN)6]; 10 mM K4[Fe(CN)6]; 10mM Na2EDTA; 0,1% Triton-100; 1,5 mM X-glucuronide) và ủ trong tủ ổn nhiệt ở nhiệt độ 370C, thời gian ủ từ 24-48h. Sau thời gian ủ, mẫu được rửa sạch bằng nước cất khử trùng và ngâm vào dung dịch cồn 70% nhằm loại bỏ diệp lục. Sau khi loại bỏ diệp lục, mẫu được đưa lên kính lúp soi nổi, quan sát chụp ảnh. Những vùng có gen GUS nhuộm màu xanh lam.
Phân tích hàm lƣợng proline trong các dịng thuốc lá chuyển gen
Các dòng thuốc lá chuyển gen sau khi sàng lọc và cho kết quả dương tính với phản ứng PCR, tiến hành thí nghiệm gây hạn nhân tạo bằng cách ngừng tưới nước ở các giai đoạn khác nhau. Xác định hàm lượng proline trong các dịng thuốc lá chuyển gen theo mơ tả trong mục 2.2.1.3.
Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng phản ứng PCR
Mẫu lá cây chuyển gen được thu và tách chiết DNA tổng số. Gen NAC2 được phân lập bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu NAC2XbaI/NAC2SacI theo chu trình nhiệt: 94ºC/3 phút, 94ºC/30 giây, 57 ºC /30 giây, 72ºC/1 phút 30 giây; 72ºC/7 phút, 30 chu kì.
Đánh giá sự có mặt của protein do gen chuyển tạo ra
Tiến hành kỹ thuật lai Western kiểm tra sự có mặt của protein do gen chuyển tổng hợp theo phương pháp của Sambrook và đtg (2001) [96].
Dựa trên nguyên lý của phản ứng miễn dịch giữa kháng nguyên (là sản phẩm protein do gen NAC2 mã hóa) và kháng thể đặc hiệu đối với kháng nguyên đó.
Trước hết protein tồn phần được chúng tơi tách chiết từ mẫu thuốc lá chuyển gen, điện di trên gel polyacrylamid, thấm truyền lên màng nitrocellulose rồi lai với
kháng thể. Quá trình hiển thị sản phẩm lai thực hiện thông qua phản ứng tạo màu.
Phân tích Western bloting
Sau khi chạy điện di biến tính trên gel polyacrylamide 12,6%, bản gel, giấy lọc và màng PVDF được ổn định 15 phút trong đệm chuyển màng (25mM Tris- HCl, 192 mM glycine, 20% methanol, pH 8,3). Thấm chuyển protein từ gel vào màng lai ở 100V trong 2h, 40C trên máy Minitransbloter (Bio-Rad, Mỹ). Sau đó màng được phủ 2h trong dung dịch TBS (Tris buffer saline: 20mM Tris-HCl, 500mM NaCl, pH 7,5) với 5% skim milk. Rửa màng bằng TTBS 1X, 3 lần, mỗi lần 5 phút. Sau đó rửa lại bằng TBS 1X, 3 lần, mỗi lần 5 phút. Phủ kháng thể 1 kháng cmyc (từ chuột), kháng thể 1 pha loãng 500 lần trong sữa skim milk 5%, lắc ở nhiệt độ phòng trong 3h, lặp lại 2 bước rửa như trên. Phủ kháng thể 2 (anti-mouse-Ig, Horseradish peroxidase) pha loãng 10000 lần trong sữa skim milk 5% trong TBS 1X, lắc ở nhiệt độ phòng trong 1h, lặp lại 2 bước rửa như trên. Hiện màu trong dung dịch hiện màu alkaline. Ủ màng trong dung dịch hiện mà và lắc ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, quan sát màu.