H nh 3.8 Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn protein NAC2 và AhNAC2.
3.3.1. Thiết kế vector tái tổ hợp chứa cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC
chống chịu hạn và những kết quả đầu tiên thu được trong việc chuyển vector mang cấu trúc chịu hạn vào cây thuốc lá. Kết quả thu được sẽ là tiền đề cho việc chuyển cấu trúc này vào cây lạc nhằm tạo ra các giống lạc có khả năng chịu hạn tốt phục vụ cho công tác chọn giống.
3.3.1. Thiết kế vector tái tổ hợp chứa cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 mã NAC2
Dựa trên trình tự gen AhNAC2 đã công bố trên ngân hàng gen (No. EU755023) [71], tiến hành thiết kế 2 cặp mồi nhân gen NAC2 ở giống lạc chịu hạn tốt L12 mang điểm cắt của các enzyme NcoI/NotI và XbaI/SacI. Điểm cắt của NcoI/NotI được sử dụng trên vector pRTRA7/3, điểm cắt của XbaI/SacI sử dụng trên
vector pBI121.
Vector pRTRA7/3 được sử dụng trong nghiên cứu của chúng tơi do có chứa 2 đoạn trình tự quan tâm là c-myc, KDEL. Hai trình tự này sẽ được ghép nối vào gen NAC2 nhằm nghiên cứu mức độ biểu hiện của gen sau khi chuyển thành công cấu trúc vào thực vật.
Gen NAC2 được nhân lên bằng cập mồi đặc hiệu NAC2NcoI/NAC2NotI, sản
phẩm PCR điện di có kích thước khoảng hơn 1kb (Hình 3.4).
Tạo vector tái tổ hợp pRTRA7/3:NAC2
Vector pRTRA7/3 có kích thước khoảng 4,2kb. Đoạn trình tự cần loại bỏ nằm trong giới hạn cắt của enzyme NcoI/NotI có kích thước khoảng 1,7kb. Vì vậy sau phản ứng cắt đoạn vector chúng tôi sử dụng cho phản ứng ghép nối có kích thước tương ứng khoảng 3,5kb.
Sản phẩm PCR được tinh sạch và xử lý cắt enzyme NcoI/NotI cùng với vector pRTRA7/3. Vector pRTRA7/3 có chứa các gen mã hóa peptide chức năng như sau:
Hình 3.11. Mơ hình thiết kế vector pRTRA7/3:NAC2
Bước 1: Loại bỏ đoạn trình tự LeB4SP/anti-ABA scFv; Bước 2: Ghép nối đoạn gen NAC2 vào vector pRTRA7/3; Bước 3: Thiết kế cặp mồi NAC2XbaI/NAC2SacI để
tách dòng gen NAC2/c-myc/KDEL từ vector pRTRA7/3:NAC2.
Sau phản ứng ghép nối, vector tái tổ hợp pRTRA7/3:NAC2 được kiểm tra bằng phản ứng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu NAC2NcoI/NAC2NotI và bằng phản ứng cắt bởi enzyme NcoI/NotI.
Hình ảnh điện di sản phẩm cắt trên hình 3.12 - A cho thấy, kết quả thu được hai phân đoạn gen có kích thước khoảng 1,1kb và 3,5kb, tương ứng với kích thước của gen NAC2 (nối thêm đoạn c-myc và KDEL) và vector pRTRA7/3. Đồng thời
thực hiện phản ứng colony - PCR với cặp mồi đặc hiệu NAC2NcoI/NAC2NotI, kết
quả trên hình 3.12 - B cho thấy, sản phẩm thu được phân đoạn gen có kích thước tương ứng với tính tốn theo lý thuyết (1,1kb).
Hình 3.12. Kết quả điện di trên gel agarose 1% (từ vector pTRA7/3:NAC2)
A. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng cắt vector pRTRA7/3:NAC2 (NotI/NcoI); B. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu
NAC2NcoI/NAC2NotI từ vector pTRA7/3:NAC2.
Tạo vector tái tổ hợp pBI121:NAC2
Vector pBI121 được sử dụng để chuyển vào tế bào thực vật thông qua A. tumefaciens.
Hình 3.13. Vector pBI121
Vector pBI121 là vector mang promoter 35S điều khiển đoạn peptide mã hóa cho β-glucuronidase với hai đầu bị cắt bởi hai enzyme giới hạn XbaI/SacI. Để thực hiện quá trình ghép nối đoạn gen NAC2/c-myc/KDEL từ vector pRTRA7/3 vào
vector pBI121 chúng tôi sử dụng cặp mồi NAC2XbaI/NAC2SacI để nhân đoạn gen NAC2/c-myc/KDEL từ vector pRTRA7/3. Kết quả nhân gen được thể hiện trong
hình 3.14 – A.
Phản ứng cắt đồng thời đoạn gen NAC2/c-myc/KDEL và vector pBI121 được
tiến hành với enzyme XbaI/SacI. Sản phẩm cắt được thôi gel, tinh sạch để tiến hành phản ứng ghép nối tạo vector tái tổ hợp pBI121:NAC2 (Hình 3.14 - B).