VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT
2.2.2.3. Chuyển gen thông qua A.tumefaciens
Phương pháp chuyển gen thơng qua mơ sẹo hóa được tiến hành dựa trên nghiên cứu của một số tác giả [12], [22], [25], [35], [70].
Tạo dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium
Lấy một khuẩn lạc mang gen quan tâm cấy vào 2 ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh kanamycine và rifamycine. Bình ni lỏng được lắc với tốc độ 200 vòng/phút ở nhiệt độ 280C trong 7- 8h. Sau đó hút 1ml dịch khuẩn ni lỏng vào 15 ml LB có bổ sung kháng sinh như trên, nuôi qua đêm (16-20h), cho đến khi OD600 = 0,7 – 1,0.
Môi trƣờng nuôi cấy
Bảng 2.2. Thành phần các môi trường trong tái sinh cây lạc Môi trƣờng Thành phần
Tạo mô sẹo MS + sucrose 30g/l + agar 8g/l + 2,4D 20mg/l Môi trường đồng
nuôi cấy (CCM )
Muối B5, MES, sucrose (pH = 5,4), vitamin B5, BAP, acetosyringon, L-cystein, sodium thiosulfat, DTT, GA3 Môi trường cảm ứng
đa chồi (SIM 1)
Muối B5, MES, sucrose (pH = 5,6),vitamin B5, BAP 2mg/l, cefotaxim, kanamycine
Môi trường cảm ứng đa chồi (SIM 2)
MS, MES, sucrose, agar, BAP 2mg/l, L - asparagine, L - pyronglutamic acid, cefotaxim, kanamycine
Môi trường ra rễ MS + IBA 0,3 mg/l
Chuẩn bị vật liệu và biến nạp
Mô sẹo sau 10 ngày nuôi cấy được chia tách và lây nhiễm trong 35ml dịch huyền phù vi khuẩn từ 15-20 phút. Đặt mẫu đã lây nhiễm trên mặt môi trường CCM, đồng nuôi cấy 5 ngày trong tối ở 25oC.
Tạo đa phôi
Mẫu mô sẹo đã lây nhiễm đưa lên môi trường tạo phôi soma trong 7 tuần.
Chọn lọc và tái sinh cây
Sau 7 tuần, rửa nhanh mẫu trong mơi trường SIM lỏng có bổ sung kháng sinh diệt khuẩn cefotaxim, sau đó thấm khơ, cấy mẫu lên mơi trường cảm ứng tạo chồi SIM1 có chứa kháng sinh chọn lọc kanamycin 50mg/l và kháng sinh diệt khuẩn cefotaxim 500mg/l. Sau 4 tuần, chuyển các mẫu tạo chồi lên mơi trường tạo chồi SIM2 có bổ sung kháng sinh diệt khuẩn và kháng sinh chọn lọc, nuôi tiếp trong 2 tuần để tăng hiệu quả chọn lọc và kéo dài chồi. Chồi đạt chiều cao từ 3-4 cm trở lên được chuyển sang môi trường ra rễ. Cây T0 hoàn chỉnh được trồng trên giá thể bầu trấu : cát (1:1) trong 2 tuần, sau đó chuyển ra bầu 40% đất, 30% trấu hun hoặc mùn mục và 30% cát vàng được trộn đều và chăm sóc trong điều kiện tự nhiên.