H nh 3.21 Kết quả điện di protein sau khi lai Western blot
3.4.3.Chuyển cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 ở cây lạc
Từ kết quả nghiên cứu chuyển cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 ở cây thuốc lá, chuyển gen chỉ thị GUS ở cây lạc, chúng tôi tiến hành chuyển cấu trúc gen chịu hạn mang nhân tố phiên mã NAC2 vào mô sẹo giống lạc LVT thông qua vi khuẩn A. tumefaciens theo quy trình đã được tối ưu.
Trong nghiên cứu này, mô sẹo sau 10 ngày nuôi cấy được sử dụng làm vật liệu chuyển gen, việc chia đôi khối mô sẹo được thực hiện ở giai đoạn này. Sử dụng dao chia tách, gây tổn thương khối mơ sẹo giúp cho mẫu thí nghiệm sản sinh ra các hợp chất phenol có tác dụng dẫn dụ vi khuẩn, làm tăng cường khả năng xâm nhiễm của vi khuẩn. Ngồi ra, tổ hợp các hợp chất có chứa thiol (L-cysteine, dithiothreitol và sodium thiosulfate) được bổ sung vào môi trường đồng nuôi cấy giúp làm tăng khả năng gắn T-DNA vào bộ gen thực vật và do đó tăng hiệu quả chuyển gen.
Bảng 3.14. Kết quả chuyển cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2
thông qua mô sẹo và phơi soma
Lơ thí nghiệm
Số phơi ni cấy
Số mô sẹo tạo phôi soma Số chồi tạo thành Số chồi ra rễ Số cây sống trên giá thể Số cây dƣơng tính với PCR 1 215 136 320 91 54 1 2 234 148 352 86 46 - 3 241 153 368 89 38 1 4 245 158 376 94 51 2 Tổng 935 595 1416 360 189 4
Quá trình chuyển gen được tiến hành trên 4 lơ thí nghiệm với tổng số 935 mẫu được sử dụng cho chuyển gen, có 595 mẫu tạo phơi soma, 1416 chồi hình thành, q trình chọn lọc kháng sinh có 189 cây sống trên giá thể.
Để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển, sau khi ra cây khoảng 1 tháng, mẫu lá của các dòng cây T0 được tiến hành thu để tách chiết DNA tổng số. Kết quả điện di sản phẩm DNA tổng số cho thấy các băng vạch thu được đều rõ, chứng tỏ DNA có chất lượng tốt, có thể dùng làm khuôn cho phản ứng PCR nhân gen.
Sử dụng DNA tổng số đã tách chiết, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu NAC2XbaI/NAC2SacI. Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy đã thu được 4 cây dương tính với phản ứng PCR chiếm tỷ lệ 0,43 % số mẫu biến nạp (dịng 24, 49, 52, 89 – hình 3.25). Các dịng cây được tiếp tục trồng để thu hạt và đánh giá sự biểu hiện của gen chuyển ở các thế hệ sau.
Hình 3.25. Kiểm tra cây lạc T0 chuyển gen bằng phản ứng PCR
M: Thang DNA chuẩn 1kb; (+): Đối chứng dương (plasmid); (-): cây không chuyển gen; 18-184: Các dịng lạc chuyển gen T0 được phân tích.
Hình 3.26. Hình ảnh chuyển cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2
qua A. tumefaciens và hệ thống tái sinh qua phôi soma
A. Đồng nuôi cấy với vi khuẩn A. tumefaciens; B. Phôi soma chuyển gen sau 7 tuần; C. Cụm chồi từ phôi soma chuyển gen trên môi trường chọn lọc; D. Chồi chuyển gen trên môi trường chọn lọc; E. Cây lạc chuyển gen trên môi trường ra rễ;
F. Cây lạc chuyển gen trên giá thể đất:trấu:cát.
Dòng 24 Dòng 49 Dòng 52 Dòng 89
Trên thế giới, nhiều cây trồng chuyển gen mã hóa NAC TF có khả năng chống chịu được các điều kiện bất lợi từ ngoại cảnh như mặn, lạnh, hạn và nhiệt độ cao đã được công bố [46], [72], [77], [113],… Các kết quả thu được ở cây lúa, ngô, đậu tương, thuốc lá,... đều chứng minh rằng việc tăng khả năng chống chịu tốt hơn với các điều kiện bất lợi từ mơi trường, từ đó cải thiện được sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng chuyển gen. Trên đối tượng cây lạc, nghiên cứu của Liu và đtg (2011) cho thấy, gen AhNAC2 sau khi được chuyển thành công vào Arabidopsis, tăng cường khả năng chống chịu với hạn và muối đã được quan sát ở cây Arabidopsis
chuyển gen qua phân tích Northern blot và RT-PCR [72].
Ở Việt Nam, nghiên cứu về nhóm nhân tố phiên mã tham gia vào qúa trình điều hịa biểu hiện gen đã và đang được quan tâm. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào đề cập đến vai trị của nhóm nhân tố phiên mã NAC trên các đối tượng cây trồng cũng như trên cây lạc. Vì vậy, nghiên cứu của chúng tôi về nhóm nhân tố NAC trên cây lạc là những kết quả ban đầu giúp tìm hiểu một phần vai trị của nhân tố phiên mã NAC liên quan đến đặc tính chịu hạn của thực vật nói chung và cây lạc nói riêng.