Phản ứng được thực hiện trên máy Realtime PCR diễn ra qua 2 giai đoạn:
giai đoạn ủ và giai đoạn lũy thừa về cường độ huỳnh quang. Giai đoạn ủ: DNA
đích đã nhân bản thành các bản sao nhưng do số lượng cịn ít nên ánh sáng
huỳnh quang phát ra chưa đủ cường độ để máy ghi nhận. Khi số lượng bản sao của DNA đích đạt đến một ngưỡng nhất định thì máy sẽ bắt đầu đo được mức
độ huỳnh quang phát ra, từ lúc này cường độ huỳnh quang trong ống phản ứng
sẽ tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ nhiệt do số lượng bản sao của DNA đích tăng gấp đơi sau mỗi chu kỳ đây là giai đoạn lũy thừa về cường độ huỳnh quang. Sự tăng trưởng này sẽ chậm dần và đạt đến bình nguyên khi các bản sao của DNA
đích khơng cịn gia tăng số lượng theo cấp số 2 nữa do cạn dần dNTP và enzym
Taq polymerase không hoạt động hiệu quả nữa, đây là giai đoạn bình nguyên [116],[118].
Hình 1.3. Minh họa biểu đồ đường biểu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng
khi nhận được ánh sáng kích thích vào mỗi chu kỳ nhiệt [113]
Phân tích một đường biểu diễn khuếch đại của một ống phản ứng sau khi hồn tất, thơng số quan trọng nhất là chu kỳ ngưỡng của một phản ứng Realtime PCR xuất hiện sớm hay muộn (Ct cao hay thấp). Chu kỳ ngưỡng là chu kỳ nhiệt mà tại thời điểm này thiết bị Realtime PCR ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang
phát ra từ ống phản ứng bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang nền. Chu kỳ ngưỡng tùy thuộc vào số lượng bản DNA đích ban đầu có trong ống phản ứng.
Đây là một đặc điểm vượt trội của Realtime PCR so với PCR, dựa vào đặc điểm
này mà có thể xác định được số copy của tác nhân đích có trong mẫu thử. Tuy nhiên, để Realtime PCR có thể xác định được chính xác số lượng
bản đích ban đầu có trong mẫu thử thì cần phải tiến hành cùng lúc với các mẫu chuẩn đã biết trước số lượng DNA đích ban đầu. Đường biểu diễn thể hiện mối quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng với số lượng DNA đích ban đầu có trong các mẫu chuẩn được gọi là đường biểu diễn chuẩn (standard curve). Đây là một đường thẳng tuyến tính đi qua các điểm tọa độ xác định bởi số lượng bản DNA đích ban đầu của từng mẫu chuẩn và chu kỳ ngưỡng tương ứng [113],[116].
Hình 1.4. Minh họa biểu đồ khuếch đại thể hiện các đường biểu diễn khuếch đại của mẫu chuẩn và mối quan hệ giữa số lượng bản DNA đích
có trong các mẫu chuẩn và chu kỳ ngưỡng tương ứng