Ưu điểm. Kỹ thuật Realtime PCR có những ưu điểm so với PCR bán định
lượng như sau:
- PCR bán định lượng chỉ xác định được điểm cuối (cao nguyên) trong khi Realtime PCR thu thập dữ liệu trong giai đoạn tăng trưởng theo cấp số nhân;
sự gia tăng tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng các bản sao DNA
được tạo thành, độ chính xác cao; tăng rộng phạm vi phát hiện, có khả năng
phát hiện xuống ít nhất là một sự thay đổi 2 lần; không phải xử lý sau khi kết thúc PCR.
- Thời gian phát hiện sản phẩm nhanh, cho phép theo dõi tiến trình phản
ứng và biết được lượng DNA đã tạo thành ở từng thời điểm.
- Phân tích kết quả phản ứng PCR mà không cần bước điện di trên gel. - Phân tích kết quả thơng qua tín hiệu huỳnh quang phát ra theo thời gian tại mỗi chu kỳ phản ứng PCR bằng máy tính.
- Tiến hành được nhiều mẫu/ngày. - Hạn chế tạp nhiễm.
- Độ lặp lại cao trong cùng lần thử nghiệm, giữa các phịng thí nghiệm
khác nhau.
Do đó, kỹ thuật Realtime PCR có thể được áp dụng cho các ứng dụng PCR thông thường cũng như các ứng dụng mới. Với khả năng thu thập dữ liệu trong giai đoạn tăng trưởng theo cấp số nhân, nên kỹ thuật này ứng dụng được trên nhiều lĩnh vực: định lượng DNA, RNA; phát hiện tác nhân gây bệnh, kiểu gen,… Realtime PCR là một công cụ mạnh mẽ cho việc định lượng biểu hiện
gen kết hợp cả độ nhạy cao và độ đặc hiệu với hiệu quả phát hiện tín hiệu
[36],[116],[119].
Nhược điểm
- Sự gia tăng của DNA trong mỗi chu kỳ sẽ phản ánh một sự gia tăng tỷ lệ thuận với sự phát sáng của huỳnh quang, tuy nhiên, chất huỳnh quang có thể liên kết với các sản phẩm khơng đặc hiệu hoặc dimer primer, vì vậy, việc thiết kế primer cho Realtime PCR phải rất cẩn thận và phải sử dụng các điều kiện PCR tối ưu để có thể giảm thiểu độ khơng đặc hiệu này.
- Việc sử dụng các probe cho phép xác định tính đa hình thái và các đột biến. Tuy nhiên, đây là kỹ thuật thực hiện phức tạp, giá thành cao hơn so với các kỹ thuật PCR định lượng khác.