ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.Đối tượng nghiên cứu
2.3.4.3. Tiến hành PCR lồng kiểm tra DNA phôi thai tự do sau chiết tách
* Kiểm tra phát hiện có DNA trong huyết tương thai phụ:
a, Thành phần phản ứng PCR: - Mix PCR 2X (Promega);
- Các cặp mồi X1X3, X2X3 (gen trên NST X) (Promega);
Bảng 2.1. Trình tự mồi của phản ứng PCR xác định gen của NST X (House’s keeping)
Tên Chức năng Trình tự Kích thước sản
phẩm PCR(bp)
X1 Mồi xi 5'- CCC TGA TGA AGA ACT TGT ATC TC-3'
301 và 261
X2 Mồi xuôi 5'- TCG CCT TTC TCA AAT TCC AAG -3'
X3 Mồi ngược 5'-GAA ATT ACA CAC ATA GGT GGC ACT-3'
Các cặp mồi được tổng hợp bởi Integrated ADN Technologies (IDT)
theo trình tự khuyến cáo của các nghiên cứu đã được công bố quốc tế. - Nước cất PCR;
DNA của mẫu chứng (chứng âm: blank, thai phụ bình thường mang thai nữ, thai phụ bình thường mang thai nam);
DNA của mẫu nghiên cứu (thai phụ bình thường và thai phụ TSG) b, Thực hiện PCR lồng để kiểm tra sự có mặt của DNA có trong huyết tương thai phụ:
- PCR lần 1: với cặp mồi X1X3 cho sản phẩm 301bp
- PCR lần 2: sản phẩm của PCR lần 1 chạy tiếp với cặp mồi X2X3 cho sản phẩm 261bp.
Điều kiện phản ứng và điện di kiểm tra sản phẩm:
94oC – 3 phút 55oC – 1 phút 1 chu kỳ 72oC – 1 phút 94oC – 1 phút 55oC – 1 phút 40 chu kỳ 72oC – 1 phút 94oC – 1 phút 55oC – 1 phút 1 chu kỳ 72oC – 6 phút 4oC – ∞
Điện di kiểm tra sản phẩm bằng thạch Agarose 1,5% trong đệm TBE
(Promega) pH=8. Đọc kết quả bằng đèn UV sau khi nhuộm Ethidium Bromide.
Đánh giá kết quả: nếu chọn cặp mồi thích hợp cho việc kiểm tra thì các
mẫu đều có sản phẩm PCR, đều có DNA trong huyết tương thai phụ, do đây là cặp mồi mã cho gen trên NST X là gen có mặt ở tất cả các thai phụ.
* Kiểm tra phát hiện có mặt đoạn gen đặc hiệu cần cho PCR định lượng
trong huyết tương thai phụ:
- Mix PCR 2X (Promega);
- Các cặp mồi Y1.5 Y1.6, Y1.7Y1.8 (gen trên NST Y) (Promega);
Bảng 2.2. Trình tự mồi của phản ứng PCR xác định gen của NST Y
Tên Chức năng Trình tự Kích thước sản
phẩm PCR(bp)
Y1.5 Mồi xuôi 5'- CTA GAC CGC AGA GGC GCC CAT - 3'
239
Y1.6 Mồi ngược 5'- TAG TAC CCA CGC CTG CTC CGG - 3'
Y1.7 Mồi xuôi 5'- CAT CGA GAG CGT CCC TGG CTT -3'
198
Y1.8 Mồi ngược 5'- CTT TCC ACA GCC ACA TTT GTC - 3'
Các cặp mồi được tổng hợp bởi Integrated ADN Technologies (IDT)
theo trình tự khuyến cáo của các nghiên cứu đã được công bố quốc tế [4],[33]. - Nước cất PCR;
- DNA:
DNA của mẫu chứng (chứng âm: thai phụ đã sinh con và biết được giới tính của thai nhi, thai phụ bình thường mang thai nữ, thai phụ bình thường mang thai nam);
DNA của mẫu nghiên cứu (thai phụ bình thường và thai phụ TSG) b, Thực hiện PCR lồng để kiểm tra sự có mặt của đoạn gen đặc hiệu cần định lượng có trong huyết tương thai phụ:
PCR lần 1: với cặp mồi Y1.5Y1.6 cho sản phẩm là 239 bp
PCR lần 2: sản phẩm của PCR lần 1 chạy tiếp PCR lần 2 với cặp mồi Y1.7Y1.8 cho sản phẩm là 198 bp.
- Điều kiện phản ứng và điện di kiểm tra sản phẩm: 94oC – 3 phút
55oC – 1 phút 1 chu kỳ 72oC – 1 phút
94oC – 1 phút 55oC – 1 phút 40 chu kỳ 72oC – 1 phút 94oC – 1 phút 55oC – 1 phút 1 chu kỳ 72oC – 6 phút 4oC – ∞
Điện di kiểm tra sản phẩm bằng thạch Agarose 1,5% trong đệm TBE
(Promega) pH=8. Đọc kết quả bằng đèn UV sau khi nhuộm Ethidium Bromide.
Đánh giá kết quả: nếu chọn cặp mồi thích hợp cho việc kiểm tra thì chỉ
những mẫu của thai phụ mang thai nam thì mới có sản phẩm PCR.