Kỹ thuật Realtime PCR dùng màu huỳnh quang chèn SYBR green I
SYBR green I thường được sử dụng vì màu huỳnh quang nền rất thấp,
khả năng chèn vào sợi đôi DNA cao nhưng không làm cho sợi đôi DNA gắn
chặt vào nhau khi bị biến tính.
Hình 1.5. Tóm tắt cơ chế hoạt động khi sử dụng chất huỳnh quang SYBR green I trong Realtime PCR [113]
Ưu và nhược điểm khi sử dụng màu huỳnh quang chèn SYBR green I trong
Realtime PCR
Ưu điểm
Màu huỳnh quang chèn vào sợi đơi DNA có ái lực rất cao khi có sự mặt của sợi đơi DNA và ái lực này là do khả năng chèn của màu vào giữa sợi đôi DNA làm cho sợi đôi DNA này phát được ánh sáng huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích.
Nhược điểm
Khó phân biệt được sản phẩm đặc hiệu hay không đặc hiệu do SYBR
green I là màu chèn cho bất cứ sợi đơi DNA nào nên nó có thể chèn vào sợi đôi DNA không phải khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích.
SYBR green I tín hiệu phát huỳnh quang khơng cao và có thể ức chế PCR, biểu đồ chuẩn khó đạt, sản phẩm khuếch đại có trình tự khác biệt hay/và chiều dài khác biệt cũng rất thấp.
Kỹ thuật Realtime PCR sử dụng probe làm chất phát huỳnh quang
Probe là những đoạn oligonucleotid sợi đơn có trình tự có thể bắt cặp bổ sung với sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích và sự bắt cặp này sẽ phát huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích.
Realtime PCR sử dụng Taqman Probe
Taqman Probe là những đoạn oligonucleotid sợi đơn có trình tự có thể
bắt cặp bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên DNA đích, dài khoảng 24 - 30 bases, có đầu 5' gắn chất phát huỳnh quang (reporter) và đầu 3' gắn chất hấp
thụ tương ứng (quencher) để hấp thụ được ánh sáng huỳnh quang phát ra từ
reporter.
Ưu và nhược điểm khi sử dụng Taqman Probe trong Realtime PCR
Ưu điểm
Taqman Probe có trình tự bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên DNA
đích.
Có thể sử dụng Taqman Probe trong Realtime PCR được thiết kế
multiplex.
Nhược điểm: Giá thành cao.
Realtime PCR sử dụng Beacon Probe
Beacon Probe là probe có trình tự dài khoảng 25 - 40 bases, có đầu 5' gắn với reporter và đầu 3' gắn với quencher. Probe có trình tự 15-39 ở giữa là bổ sung với 1 trình tự đặc hiệu trên sợi đơn vủa DNA đích, cịn 2 đầu cịn lại
của probe có trình tự 5 - 6 bases bổ sung với nhau làm cho probe tạo thành cấu trúc hình kẹp tóc.
Hình 1.7. Tóm tắt cơ chế hoạt động của Beacon probe trong Realtime PCR [113]
Ưu và nhược điểm khi sử dụng Beacon Probe trong Realtime PCR
Ưu điểm:
- Rất đặc hiệu.
- Rất tốt để thực hiện multiplex phát hiện cùng lúc nhiều tác nhân đích.
Nhược điểm:
- Beacon tương đối khó thiết kế vì phải chú ý để có sự bắt cặp đủ mạnh làm cho probe có cấu trúc kẹp tóc.
- Sự bắt cặp của trình tự ở hai đầu cũng không được quá mạnh để khơng ngăn cản probe bắt cặp vào sợi đích khi có mặt của sợi đích.
- Giá thành cao.
Realtime PCR sử dụng probe lai
Trong kỹ thuật này dùng 2 probe: probe lai 1 có đầu 3’ gắn một chất phát huỳnh quang D (donnor) và probe lai 2 có đầu 5’ gắn một chất phát huỳnh
quang A (acceptor) [113],[116].
Ưu điểm khi sử dụng Probe lai trong Realtime PCR
Ứng dụng để định lượng tác nhân đích có trong mẫu và định kiểu gen
của tác nhân đích hay là định được sự khác biệt chỉ một nucleotid (SNP) của
tác nhân đích.