M: Thang DNA 100 Giếng 1: Chứng nước cất
Chương 4 BÀN LUẬN
4.2.1. Hoàn chỉnh kỹ thuật chiết tách DNA phôi thai tự do theo quy trình của Randen I và CS
của Randen I. và CS
Năm 1997, Lo và CS phát hiện được DNA tự do trong huyết tương và huyết thanh thai phụ [4]. Nhưng do số lượng thấp của những tế bào thai được tìm thấy trong tuần hoàn mẹ (khoảng 1 tế bào thai/1 ml máu mẹ) đã làm giới hạn việc áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử cho việc phân tích gen học từ các tế bào chiết tách từ máu mẹ dẫn đến hạn chế sự phát triển và ứng dụng
chúng vào chẩn đoán trước sinh thường quy.
Có nhiều phương pháp được sử dụng để chiết tách DNA và lựa chọn
phương pháp tách chiết phù hợp cho mẫu thử là một yếu tố rất quyết định để
giúp thành công trong các xét nghiệm PCR hay Realtime PCR. Một số qui trình chiết tách DNA phơi thai tự do từ máu mẹ: qui trình của Lo Y.M. và CS (1997), qui trình của Randen I. và CS (2003) và qui trình của Benachi A. và CS (2005) [4],[120],[123]. Tuy nhiên, chúng tôi tiến hành chiết tách DNA phôi thai tự do theo qui trình của Randen I. và CS (2003) vì qui trình này sử dụng QIAgen Blood Mini Kit (QIAgen, Hilden, Germany) giá thành phù hợp và vẫn đảm bảo
được sản phẩm DNA phôi thai tự do thu được sau chiết tách, đồng thời có cải
tiến qui trình này để áp dụng trong nghiên cứu:
Việc đánh giá sự chiết tách và tinh khiết DNA được tiến hành trên sự
tăng tổng lượng huyết tương (200-800µl) đã xác nhận rằng 400µl huyết tương cho phép thu được số lượng DNA cao hơn so với 200µl huyết tương như nhà sản xuất đã đưa ra, lượng huyết tương cao hơn (600 – 800µl) cho phép thu số lượng DNA cao hơn.
Trong bước cuối cùng đã được tối ưu hóa, rửa kỹ sau bổ sung huyết
DNA dễ dàng. Do vậy, phải điều chỉnh lượng huyết tương và lượng AE làm thôi DNA từ cột sao cho lượng DNA chiết tách từ huyết tương thai phụ đạt
nồng độ và độ tinh khiết tối ưu của lượng DNA chiết tách từ huyết tương thai phụ chuẩn bị cho PCR.
Yêu cầu sản phẩm sau khi chiết tách DNA để dùng cho PCR và Realtime PCR: mẫu DNA không được dài quá, thường khuếch đại tốt nhất đối với đoạn DNA dài khoảng < 300bp. DNA thu nhận được sau chiết tách phải tinh sạch, loại bỏ được tạp nhiễm và các phân tử DNA thu được ở trạng thái nguyên vẹn tối đa.
Từ kết quả Bảng 3.10. kết quả đo độ tinh sạch của DNA sau chiết tách từ huyết tương của thai phụ khi đo OD260/OD280 ở 101 thai phụ bình thường:
1,98 ± 0,12 ở 50 thai phụ TSG: 1,95 ± 0,15 do đó đảm bảo độ tinh sạch của
DNA.