NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.2. Bước đầu khảo sát liều lượng demecolcine và thời gian ủ với chất này khi tạo tiêu bản NST tha
này khi tạo tiêu bản NST thai
Quy cách sử dụng demecolcine được xét đến ở đây bao gồm liều lượng (µg demecolcine/ml mơi trường chứa trong bình cấy) và thời gian ủ với chất này khi tạo tiêu bản NST thai từ dịch ối nuôi cấy.
Do điều kiện cơ sở vật chất có hạn nên chỉ một phương pháp được chọn để thực hiện nội dung 2. Mặc dù phương pháp 1 và 2 đều thể hiện hiệu quả tốt khi nuôi cấy, tuy nhiên các slide flask để thực hiện phương pháp 2 là dụng cụ rất đắt tiền so với bình cấy flask của phương pháp 1, hơn nữa hiện nay phương pháp phổ biến được dùng ở nước ta là phương pháp 1, do đó phương pháp nuôi cấy 1 được dùng
để tiến hành nội dung 2. Các dịch ối đã được trộn lẫn và chia đều vào các lô để đạt được sự tương đồng trong nguyên liệu sử dụng ở các lơ thí nghiệm.
Nội dung nghiên cứu 2 được thực hiện gồm 3 phần:
- Thử nghiệm 2.1: Đánh giá ảnh hưởng của liều lượng demecolcine và
thời gian ủ với chất này lên chất lượng cụm NST quan sát
Thí nghiệm 2.1 gồm 2 yếu tố khảo sát, yếu tố liều lượng gồm 4 mức (0,125 µg/ml, 0,25 µg/ml, 0,375 µg/ml và 0,5 µg/ml) thời gian gồm 4 mức (30, 60, 90 và 120 phút) được bố trí như sau:
Liều lượng (µg/ml)
Thời gian (ph) 0,125 0,25 0,375 0,5
30ph A1 A2 A3 A4
60ph A5 A6* A7 A8
90ph A9 A10 A11 A12
120ph A13 A14 A15 A16
(* lô đối chứng)
Lô A6 xử lý với 0,25 µg/ml trong 60 phút là điều kiện xử lý thu hoạch tại phịng thí nghiệm Khoa Di truyền, bệnh viện Từ Dũ (2009) được chọn làm lô đối chứng.
Lượng dịch ối sử dụng có giới hạn nên khơng thể tiến hành lặp lại tồn bộ các lơ thử nghiệm 2.1, do đó, dựa trên kết quả của thử nghiệm 2.1 chọn ra các điều kiện thí nghiệm cho kết quả tốt để tiếp tục các thử nghiệm sau.
- Thử nghiệm 2. 2: Đánh giá chất lượng cụm NST khi xử lý với các liều
lượng demecolcine khác nhau trong 60 phút
Thí nghiệm này gồm 4 lô, mỗi lô xử lý với liều demecolcine tương ứng là 0,125 µg/ml, 0,25 µg/ml (đối chứng), 0,375 µg/ml và 0,5 µg/ml trong 60 phút. Thử nghiệm này được thực hiện để xác định liều lượng demecolcine xử lý ở thời gian 60 phút cho kết quả tốt nhất.
- Thử nghiệm 2.3: Đánh giá chất lượng cụm NST khi xử lý bằng liều 0,25
µg/ml demecolcine ở các mức thời gian khác nhau
Thí nghiệm này gồm 4 lơ, mỗi lơ xử lý bằng 0,25 µg/ml demecolcine ở các mức thời gian tương ứng là 30, 60, 90 và 120 phút. Thử nghiệm này được thực hiện để một lần nữa khẳng định kết quả của thử nghiệm 2.2 về hiệu quả khi xử lý ở liều 0,25 µg/ml demecolcine thơng qua việc đánh giá chất lượng cụm NST ở các mức thời gian khác nhau.
Sau khi các mẫu ối được ni cấy, các điều kiện thí nghiệm sẽ được tác động ở giai đoạn đầu quá trình thu hoạch khi xử lý làm ngưng tế bào ở kỳ giữa bằng demecolcine, các tiến trình thu hoạch ở giai đoạn sau đó là như nhau.
Q trình thu hoạch [59]:
- Cho vào flask tế bào ối đã được ni cấy một liều demecolcine 0,125µg/ml (hoặc 0,25µg/ml, 0,375 µg/ml hay 0,5 µg/ml tùy lơ), lắc đều, tiếp tục ủ trong 30 phút (hay 60, 90 hoặc 120 phút tùy lô).
- Hút môi trường cũ ra khỏi bình flask cho vào ống ly tâm. Cho 2ml trypsin- EDTA 0,05%, lắc đều, ủ 10 phút làm bong tế bào.
- Ức chế tác động của trypsin bằng 4ml môi trường cũ, hút hết dịch trong flask cho vào ống ly tâm. Tráng flask bằng 2ml dung dịch NaCl 0,09%, tráng lần 2 với 1ml dung dịch NaCl 0,09% (nếu cần).
- Ly tâm 1000 vòng/10 phút, loại bỏ dịch nổi.
- Cho vào mỗi ống ly tâm 10ml KCl 0,075M, rung lắc đều để huyền phù dịch tế bào, sau đó ly tâm ngay 1000 vòng/10 phút.
- Rung lắc lại ống ly tâm, sau đó đem ủ trong tủ ấm 37oC trong 20 phút. - Thêm 8 giọt dung dịch cố định, rung lắc đều sau đó đem ly tâm. - Hút bỏ dịch nổi, thêm vào 6ml carnoy, ủ 4oC trong 20 phút. - Ly tâm 1000 vòng/10 phút, loại bỏ dịch nổi.
- Tiếp tục xử lý với dung dịch cố định thêm 2 lần nữa. Ủ lạnh 4oC đến khi nhỏ lên phiến kính.
Phương pháp làm tiêu bản hiển vi
- Nhỏ dịch nuôi cấy lên phiến kính sau đó sấy phiến kính ở 550C
- Nhuộm phiến kính bằng phương pháp nhuộm thường quy hay nhuộm băng
Phương pháp nhuộm thường quy
- Sấy phiến kính ở 900C trong 1 giờ - Nhuộm với giemsa trong 5-7 phút.
- Quan sát trên kính hiển vi và ghi nhận kết quả
Phương pháp nhuộm băng G
- Sấy phiến kính ở 900C trong 1 giờ
- Nhúng mẫu trong trypsin EDTA 0,05% trong khoảng vài giây - Để khơ tự nhiên, sau đó nhuộm với giemsa trong 5-7 phút.
Các chỉ tiêu khảo sát: Tiêu bản NST tốt phải có nhiều cụm NST, các NST
trong cụm không gối lên nhau (độ bung tốt). Các chỉ tiêu đánh giá chất lượng NST được khảo sát bao gồm chỉ số cụm NST quan sát ở độ phóng đại 200x, độ bung của các NST.
(1) Chỉ số cụm NST ở kỳ giữa: mỗi mẫu được thu hoạch và nhỏ lên 3 phiến kính, chọn lấy 2 phiến kính có nhiều cụm, đếm 20 quang trường ở độ phóng đại 100x, tổng số cụm ở 20 quang trường được đếm ở 200x và tính ra số cụm trung bình trong mỗi quang trường (chỉ số cụm NST) của mỗi lô. Kết quả chỉ số cụm NST được ghi nhận và đánh giá ở 3 mức độ [40]:
Nhiều (>5 cụm NST/quang trường)
Trung bình (2-5 cụm NST/quang trường)
Ít (<2 cụm NST/quang trường)
(2) Độ bung của các nhiễm sắc thể trong cụm quan sát: được xác định dựa trên mức độ gối lên nhau của các NST trong cụm quan sát được trong quang trường với độ phóng đại 1000x. Độ bung được đánh giá và xếp loại theo 3 mức độ (tham khảo [54] có điều chỉnh):
Trung bình (≤ 5 vị trí gối nhau): tương ứng mức ++
Tốt (các NST không gối lên nhau): tương ứng mức +++
Độ bung của các nhiễm sắc thể ở các cụm trên tổng số 20 quang trường quan sát được thống kê để xác định tỷ lệ % mỗi mức độ bung/mẫu thí nghiệm.