NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1.3. Phương pháp thu hoạch tế bào [59]
Thu hoạch tế bào nuôi cấy bằng phương pháp 1
- Cho vào bình cấy flask 0,1ml demecolcine (10 µg/ml), lắc đều, tiếp tục ủ trong 1 giờ.
- Hút môi trường cũ ra khỏi bình cấy flask cho vào ống ly tâm. Cho 2ml Trypsin- EDTA 0,05%, lắc đều, ủ 10 phút làm bong tế bào.
- Ức chế tác động của trypsin bằng 4ml môi trường cũ, hút hết dịch trong bình cấy flask cho vào ống ly tâm. Tráng bình cấy flask bằng 2ml dung dịch NaCl 0,09%, tráng lần 2 với 1ml dung dịch NaCl 0,09% (nếu cần).
- Ly tâm 1000 vòng/10 phút, loại bỏ dịch nổi.
- Cho vào mỗi ống ly tâm 10ml KCl 0,075M, rung lắc đều để huyền phù dịch tế bào,sau đó ly tâm ngay 1000 vịng/10 phút.
- Rung lắc lại ống ly tâm, sau đó đem ủ ở 37oC trong 10 phút. - Thêm 8 giọt dung dịch cố định, rung lắc đều sau đó đem ly tâm. - Hút bỏ dịch nổi, thêm vào 6ml dung dịch cố định, ủ 4oC trong 20 phút. - Ly tâm 1000 vòng/10 phút, loại bỏ dịch nổi.
- Tiếp tục xử lý với dung dịch cố định thêm 2 lần nữa. - Ủ lạnh 4oC đến khi nhỏ lên phiến kính.
Thu hoạch tế bào ni cấy bằng phương pháp 2 và 3
- Cho vào đĩa cấy petri hoặc slide flask 0,05ml demecolcine (10 µg/ml), ủ trong 20 phút.
- Hút bỏ môi trường cũ.
- Cho vào mỗi đĩa cấy petri hoặc slide flask 2ml KCl 0,075M, sau đó đem ủ ở 37oC trong 20 phút.
- Thêm 1ml dung dịch cố định, để yên khoảng 2 phút.
- Hút bỏ dịch, thêm vào 2ml dung dịch cố định, ủ 4oC ít nhất trong 20 phút. - Hút bỏ dịch, tiếp tục xử lý với dung dịch cố định thêm 2 lần nữa.
- Hút bỏ hoàn toàn dung dịch cố định, để lá kính khơ tự nhiên. Đối với slide flask, sau khi hút bỏ dung dịch cố định thì nạy bỏ phần trên của slide flask. Trước khi nhuộm, cả lá kính và slide flask đều cần được xử lý nhiệt. Riêng lá kính sau đó sẽ được dán lên phiến kính.