KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1.1.1. Tỷ lệ thành công ở mỗi phương pháp nuôi cấy
Với kết quả sơ bộ của một số mẫu nuôi cấy thử nghiệm ban đầu, chúng tôi nhận thấy các mẫu không xuất hiện cụm tế bào sau 8 ngày ni cấy thì sau đó tất cả chúng đều không xuất hiện cụm tế bào. Đối với các trường hợp không đạt mức phát triển (++) sau 15 ngày ni cấy thì sau đó khả năng sinh sản của tế bào rất kém, không đủ tiêu chuẩn số cụm tế bào để thu hoạch hoặc khi thu hoạch thì khơng nhận được tế bào ở kỳ giữa. Từ đó các trường hợp nuôi cấy được đánh giá là thất bại nếu có các đặc điểm sau:
Bị nhiễm khuẩn hoặc nhiễm nấm
Nuôi cấy sau 8 ngày vẫn không xuất hiện cụm tế bào
Nuôi cấy sau 15 ngày mà số cụm tế bào vẫn không đạt tiêu chuẩn mức phát triển (++)
Bảng 4.1: Tỷ lệ thành công của 3 phương pháp nuôi cấy tế bào ối
Kết quả
Phương pháp nuôi cấy
Phương pháp 1 Phương pháp 2 Phương pháp 3 n % n % n % Thành công 43 87,8ab 43 95,6a 36 73,5b Thất bại 6 12,2 2 4,4 13 26,5 Tổng cộng 49 100,0 45 100,0 49 100, 0
(a, b biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa giữa các tỷ lệ ở P<0,05)
Qua Bảng 4.1 cho thấy phương pháp 2 có tỷ lệ ni cấy thành công cao nhất (95,6%), tiếp đến là phương pháp 1 với 87,8%, tuy nhiên mức chênh lệch giữa 2 phương pháp này không đáng kể. Tỷ lệ thành công đạt thấp nhất ở phương pháp 3 (73,5%). Tỷ lệ nuôi cấy thất bại ở phương pháp 3 cao gấp 2,2 lần so với phương pháp 1 và cao gấp 6 lần so với phương pháp 2.
Thống kê số trường hợp nuôi cấy thất bại ở 3 phương pháp
Lý do thất bại PP1 PP2 PP3
Nhiễm khuẩn 4 2 2
Tế bào không mọc 0 0 4
Tế bào mọc nhưng sau đó khơng phát triển 2* 0 7**
** Gồm 3 mẫu có tế bào mọc sau 5-7 ngày ni cấy, 1 mẫu có tế bào mọc ngày 11 và 3 mẫu đạt mức (+) vào ngày 11-12 nhưng sau đó khơng phát triển
Trong số các trường hợp ni cấy thất bại do nhiễm khuẩn, có 1 mẫu dịch ối khi nuôi cấy bằng 3 phương pháp đều bị nhiễm khuẩn, vấn đề có thể phát sinh ở khâu xử lý mẫu dịch ối trước khi cấy.
Có 4 mẫu (8,2%) của phương pháp 3 khơng có tế bào mọc mặc dù kiểm tra dưới kính hiển vi không phát hiện hiện tượng nhiễm khuẩn, điều này có thể lý giải một phần do đáy bình cấy flask và slide flask được chế tạo mang các đặc điểm giúp tế bào có thể bám và phát triển, trong khi đó lá kính là dụng cụ khơng chun dùng cho mục đích ni cấy tế bào nên khả năng bám của tế bào trên bề mặt lá kính kém hơn. Bên cạnh đó, phương pháp 3 địi hỏi phải bổ sung môi trường vào 24 giờ sau khi cấy, sự dịch chuyển mẫu cấy trong thời gian đầu này có thể làm giảm khả năng bám của tế bào lên lá kính.
Có 2 mẫu của phương pháp 1 (4,1%) và 7 mẫu của phương pháp 3 (14,3%) đã có tế bào mọc hoặc đã phát triển đạt mức (+) nhưng sau đó các tế bào khơng tiếp tục phát triển, thời gian sau đó các tế bào cũng dần biến mất. Lý do của hiện tượng trên chưa được xác định, tuy nhiên Raddatz (2005) lưu ý rằng khi lượng tế bào chết nhiều sẽ gây tích lũy các chất tiết ra từ các tế bào đó, hiện tượng này cũng gây ức chế các tế bào đang sống phát triển tạo cụm tế bào [53].
Việc ứng dụng phương pháp mới trong nuôi cấy tế bào ối (phương pháp 2) cho tỷ lệ thành công >95% là kết quả rất khả quan. Khơng có mẫu nào của phương pháp 2 khơng mọc hoặc có tế bào mọc nhưng không phát triển, điều này góp phần thể hiện các tế bào của phương pháp 2 mọc và tạo cụm tốt hơn phương pháp 1 và 3. Có thể do với cùng lượng tế bào ối được cấy nhưng phương pháp 2 có mật độ tế bào/đơn vị diện tích lớn hơn phương pháp 1 giúp khả năng phát sinh và phát triển cụm tốt hơn. Ngồi ra kết quả này cịn chịu ảnh hưởng của mức độ thành thạo trong các thao tác nuôi cấy của kỹ thuật viên.
87.8 95.6 95.6 73.5 12.2 4.4 26.5 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% PP1 PP2 PP3 Phương pháp Tỷ lệ % thành công thất bại
Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ thành công – thất bại ở 3 phương pháp
Ở Việt Nam, phương pháp 1 là phương pháp nuôi cấy tế bào ối hiện đang rất phổ biến, tuy nhiên khi ứng dụng thực tế thì hầu hết các cơ sở nghiên cứu, các bệnh viện đều gặp phải những khó khăn do sự khác biệt điều kiện cơ sở vật chất so với nơi giới thiệu quy trình ni cấy. Do đó đã có một số nghiên cứu thay đổi một số điểm trong quy trình thực hiện nhằm duy trì nâng cao hiệu quả ni cấy. Năm 2005, Bùi Võ Minh Hoàng đã so sánh hiệu quả 2 quy trình ni cấy bằng bình cấy. Quy trình 1 dùng 3 ml dịch ối, ly tâm chừa 0,5ml dịch nổi sau đó thêm 4ml mơi trường rồi ni cấy, quy trình 2 dùng 3ml dịch ối, ly tâm chừa 2ml dịch nổi sau đó thêm 2ml môi trường rồi tiến hành nuôi cấy, cả 2 quy trình đều có tỷ lệ thành công là 95% (38 mẫu thành công trong tổng số 40 mẫu nuôi cấy) [3]. Tỷ lệ trên của tác giả Bùi Võ Minh Hoàng cao hơn so với tỷ lệ thành công của phương pháp 1 ở nghiên cứu này nhưng do lượng dịch ối sử dụng trong nghiên cứu trên của tác giả Bùi Võ Minh Hoàng là 3ml, gấp 1,5 lần so với trong thí nghiệm này, nên có lẽ lượng dịch ối sử dụng cũng ảnh hưởng tới tỷ lệ thành công của nuôi cấy. Tuy nhiên ảnh hưởng
của thể tích dịch ối sử dụng ni cấy tế bào không được khảo sát trong nghiên cứu này.
Kết quả thu được từ phương pháp 2 là tương đương với nghiên cứu của Zheng và cộng sự (2002), khi tác giả nuôi cấy dịch ối in situ trên flask cho tỷ lệ nuôi cấy thành công là 100% [51].
Tuy nhiên, kết quả nuôi cấy của phương pháp 1 và 3 ở đây khơng hồn tồn giống với một số nghiên cứu khác trên thế giới. Có thể kể đến các cơng trình như nghiên cứu của Hecht và cộng sự (1981) nuôi cấy 1429 mẫu dịch ối trên lá kính, tỷ lệ ni cấy thất bại từ 1-2%, tỷ lệ sai số là 0% [18]; nghiên cứu của Liang và cộng sự (2008) so sánh phương pháp ni cấy trên lá kính và phương pháp dùng bình cấy flask trên 155 mẫu dịch ối cho tỷ lệ thành công chung là 97,4%, với nuôi cấy bằng lá kính cho tỷ lệ thành cơng cao hơn [26]. Tương tự, nhóm của Pan (2006) báo cáo kết quả nuôi cấy và thu hoạch in situ trên 715 mẫu dịch ối cho tỷ lệ thành công là 100% [33]. Kết quả của các tác giả trên đều cao hơn của nghiên cứu này, như thế chứng tỏ có sự ảnh hưởng đáng kể của mức độ thành thạo trong thao tác và điều kiện kỹ thuật của nơi thực hiện thí nghiệm tới kết quả nuôi cấy.