KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1.1.3. Phân bố mẫu theo thời gian đạt các mức phát triển
Thời điểm bám tạo cụm được chia thành 3 khoảng: từ ngày thứ 5 sau khi cấy trở về trước (≤5), vào khoảng ngày thứ 6 đến ngày thứ 7 (6-7), từ ngày thứ 8 trở về sau (≥8). Ở phương pháp 3 có 9,1% mẫu có tế bào bám chậm và tạo cụm sau cấy hơn 8 ngày. Tuy nhiên, sự khác biệt của kết quả này ở 3 phương pháp khơng có ý nghĩa thống kê.
Phân bố mẫu theo thời gian xuất hiện tế bào bám và tạo cụm của các mẫu nuôi cấy bằng 3 phương pháp tương đương nhau. Không xét đến các mẫu không mọc hoặc bị nhiễm khuẩn, hầu hết các mẫu ni cấy có tế bào bám và tạo cụm chỉ sau khi cấy ≤5 ngày, trong đó tỷ lệ cao nhất ở phương pháp 2 với 97,8%, tiếp đến là phương pháp 1 với 93,8%, cả 2 đều cao hơn phương pháp 3 với 84,1%.
Bảng 4.3: Phân bố (%) mẫu theo thời gian xuất hiện tế bào bám và tạo cụm ở các phương pháp
Phương pháp Đơn vị tính
Thời gian tế bào bám và tạo cụm (ngày)
≤5 6-7 ≥8 PP 1 (48 mẫu) n 45 3 0 % 93,8 6,3 0,0 PP 2 (45 mẫu) n 44 1 0 % 97,8 2,2 0,0 PP 3 (44 mẫu) n 37 3 4 % 84,1 6,8 9,1
So sánh giữa phương pháp 1 và 2, với cùng lượng tế bào ối được cấy nhưng phương pháp 1 được cung cấp lượng môi trường lớn hơn 50% so với phương pháp 2 nhưng không ảnh hưởng đáng kể đến thời gian bám và tạo cụm. Điều này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Raddatz (2005) cho thấy số lượng tế bào ối/môi trường khác nhau không ảnh hưởng tổng thời gian nuôi cấy, và ảnh hưởng không đáng kể đến số cụm; tuy nhiên thời gian để đạt được số lượng cụm tế bào tương đương có thể bị kéo dài ở mẫu có tỷ lệ tế bào ối/môi trường nhỏ. Tác giả Raddatz cũng phát hiện rằng để tạo cụm, lượng mẫu nhỏ cho hiệu quả hơn, 4,7% khác nhau trong tổng số cụm ở lần kiểm tra đầu tiên do kinh nghiệm của kỹ thuật viên, và mức độ nhiễm máu mẹ khác nhau chịu trách nhiệm cho khoảng 3% sự khác nhau trong số lượng cụm [53].
Như vậy ở đây, bên cạnh yếu tố kinh nghiệm của kỹ thuật viên và ảnh hưởng không đáng kể của số lượng tế bào ối/thể tích mơi trường ni cấy, sự khác biệt trong phân phối mẫu theo thời gian bám tạo cụm có thể lý giải một phần do quy trình thực hiện khi nuôi cấy. Với phương pháp 1 và 2, sau khi cấy tế bào vào bình, mẫu được giữ cố định trong tủ đến lần quan sát đầu tiên, làm khả năng bám của tế bào tốt hơn. Còn với phương pháp 3, sau khi lá kính được cấy tế bào 24 giờ thì đĩa petri được lấy ra và thêm môi trường, sự di chuyển sau khi cấy thời gian ngắn có thể làm chậm việc bám của tế bào trên lá kính.
Hơn nữa, đáy bình cấy flask và slide flask được chế tạo mang các đặc điểm giúp tế bào có thể bám và phát triển. Trong khi đó, lá kính là dụng cụ không chuyên dùng cho mục đích ni cấy tế bào nên khả năng bám của tế bào trên bề mặt lá kính kém hơn, thời gian cần thiết để bám và tạo cụm bị kéo dài. Mặt khác, do khoảng cách giữa thời điểm cấy và lúc bắt đầu quan sát cách nhau khá xa nên thời điểm bám và tạo cụm chỉ được ước lượng trong từng khoảng thời gian, nên kết quả ở đây chưa thể hiện được sự khác biệt rõ rệt giữa 3 phương pháp.
Để có cái nhìn tổng quát hơn về mức độ phát triển của các mẫu cấy, phân bố mẫu theo thời gian đạt các mức phát triển của các mẫu cấy được đánh giá vào các
lần quan sát, kết quả thu được từ 3 phương pháp lần lượt được thể hiện qua bảng 4.4 và 4.5 dưới đây.
Có >87,5% số mẫu đạt mức (+) sau khi cấy ≤7 ngày. Trong đó, phương pháp 2 và phương pháp 1 có số mẫu đạt mức này vào thời điểm ≤5 ngày sau khi cấy, cao hơn phương pháp 3 từ 1,6-2,0 lần. Bên cạnh đó, ở phương pháp 3 có đến 7,5% đạt mức (+) sau hơn 10 ngày. Tuy nhiên, sự khác biệt này ở 3 phương pháp khơng có ý
nghĩa thống kê.
Bảng 4.4: Phân bố (%) mẫu theo thời gian đạt mức phát triển (+) của các mẫu ối ở các phương pháp
Phương pháp
Đơn vị tính
Thời điểm (ngày)
≤5 6-7 8-9 10-11 ≥12 PP 1 (47 mẫu) n 19 25 3 0 0 % 40,4 53,2 6,4 0,0 0,0 PP 2 (45 mẫu) n 23 20 1 1 0 % 51,1 44,5 2,2 2,2 0,0 PP 3 (40 mẫu) n 10 25 2 2 1 % 25,0 62,5 5,0 5,0 2,5
Phân bố mẫu theo thời gian phát triển đến mức (++) ở phương pháp 1 và 2 tương đương nhau và tốt hơn ở phương pháp 3, thời gian đạt mức (++) của phương pháp 1 và 2 sớm hơn phương pháp 3. Phương pháp 1 và 2 có số mẫu đạt mức này nhiều nhất vào khoảng ngày 6-7. Trong khi đó ở phương pháp 3, số mẫu đạt mức này
nhiều nhất vào khoảng ngày 8-9, chậm hơn so với 2 phương pháp trên. Phương pháp 1 có 97,8% mẫu đạt mức này vào 6-9 ngày sau khi cấy, và phương pháp 2 có 89% mẫu đạt mức này sau 6-9 ngày, bên cạnh đó có 6,8% mẫu đạt mức (++) khơng q 5 ngày sau khi cấy. Ngoài ra, 94,4% mẫu của phương pháp 3 đạt mức này sau 6-9 ngày, khơng có mẫu nào đạt trước 6 ngày sau khi cấy.
Bảng 4.5: Phân bố (%) mẫu theo thời gian đạt mức phát triển (++) của các mẫu ối ở các phương pháp
Phương pháp Đơn vị tính
Thời điểm (ngày)
≤5 6-7 8-9 10-11 ≥12 PP 1 (45 mẫu) N 0 31 13 1 0 % 0a 68,9a 28,8a 2,2a 0,0 PP 2 (44 mẫu) N 3 27 12 1 1 % 6,8a 61,4a 27,3a 2,3a 2,3 PP 3 (36 mẫu) N 0 13 21 2 0 % 0b 36,1b 58,3b 5,6b 0,0
(a,b biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa giữa các tỷ lệ xét theo cột với P<0,05)
Kết quả này của phương pháp 1 tương tự kết quả của Tsai và cộng sự (2004). Nhóm tác giả đã thu nhận các tế bào ối lơ lửng từ môi trường nuôi cấy sơ cấp, sau đó ni cấy trong bình cấy flask bằng môi trường α-MEM bổ sung 20% FBS và 4ng/ml bFGF (nhân tố cơ bản phát triển nguyên bào sợi). Các tác giả phát hiện cụm
tế bào bắt đầu xuất hiện vào ngày thứ 5 sau khi cấy, và trong vòng 7 ngày các cụm tế bào này phát triển độ che phủ 90% [46].
0 10 20 30 40 50 60 70 80
≤5 ngày 6-7 ngày 8-9 ngày 10-11 ngày ≥12 ngày
Thời gian
%
PP1 PP2 PP3
Biểu đồ 4.3: Phân bố (%) mẫu theo thời gian đạt mức phát triển (++) ở các phương pháp
Mặt khác, thời gian đạt mức (++) của các mẫu dịch ối nuôi cấy bằng phương pháp 2 sớm hơn 2 ngày so với tác giả Chang (1982), có lẽ do mơi trường ni cấy sử dụng trong nghiên cứu này (môi trường AmnioMax C-100) khác với môi trường sử dụng trong nghiên cứu của Chang. Tác giả Chang đã nuôi cấy dịch ối thai 16-18 tuần trên chamber/slides bằng 3 loại môi trường: môi trường SF (không huyết thanh), môi trường H (SF bổ sung 10 nhân tố sinh trưởng), và môi trường H-I (SF bổ sung 10 nhân tố sinh trưởng với nồng độ gấp đôi – thành phần môi trường được bổ sung trong phần phụ lục). Các môi trường này được thêm FBS với nồng độ khác nhau. Các tế bào nuôi cấy ở FBS 8% trong môi trường H-I tạo cụm nối nhau liên
tục vào ngày 8-10 sau khi cấy, nuôi cấy bằng môi trường H-I với 4% FBS đã cho cụm tế bào phát triển rất tốt vào ngày 8-13 [13].
Như vậy, phân bố mẫu theo thời gian xuất hiện tế bào bám tạo cụm và đạt mức (+) ở 3 phương pháp không khác biệt đáng kể, nhưng phân bố mẫu theo thời gian phát triển đạt mức (++) ở phương pháp 1 và 2 tương đối đồng đều và tốt hơn ở phương pháp 3. Như vậy, quy trình của phương pháp ni cấy và dụng cụ nuôi cấy ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển của mẫu nuôi cấy.