KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1.1.4. Thời gian nuôi cấy
Bảng 4.6: Thời gian nuôi cấy tế bào ối ở 3 phương pháp
Phương pháp nuôi cấy N
Thời gian nuôi cấy (ngày)
X ± SD (CI)
Phương pháp 1 43 11,6a ± 1,9 (11,0-12,2)
Phương pháp 2 43 10,0b ± 2,0 (9,4-10,6)
Phương pháp 3 36 10,4ab± 1,8 (9,8-11,0) (a,b biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa giữa các giá trị ở P<0,05)
Bảng 4.6 cho thấy trung bình thời gian nuôi cấy của phương pháp 2 và 3 khoảng 10-10,4 ngày, ngắn hơn 1,2-1,6 ngày so với phương pháp 1. Mặc dù thời gian bám và tạo cụm của phương pháp 1 gần như tương đương với phương pháp 2 và tốt hơn phương pháp 3, nhưng thời gian nuôi cấy của phương pháp 2 và 3 ngắn hơn phương pháp 1, điều này có thể được lý giải do các lý do sau:
- Với cùng lượng dịch ối ni cấy nhưng diện tích đáy bình flask lớn hơn đáy slide flask và lá kính. Diện tích nhỏ của slide flask và lá kính làm tăng mật độ tế bào ối trong 1 đơn vị diện tích bề mặt, có thể nhờ đó khả năng phát triển cụm tốt hơn, do
đó cũng góp phần rút ngắn thời gian nuôi cấy. Tuy nhiên ảnh hưởng của yếu tố mật độ tế bào đến số lượng tế bào/cụm sẽ khơng được xét đến trong thí nghiệm này.
- Kết quả thời gian đạt mức (+), (++) của cả 3 phương pháp cho thấy sau khi các tế bào ối đã bám và tạo cụm, các mẫu cấy của phương pháp 2 và 3 càng phát triển tốt hơn.
- Với việc thu hoạch in situ làm giảm lượng tế bào bị mất trong quá trình thu
hoạch [13] nên tiêu chuẩn phát triển đủ để thu hoạch ở phương pháp 2 và 3 thấp hơn, rút ngắn thời gian nuôi cấy cần thiết.
11.6 10.0 10.0 10.4 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 T h ờ i g ia n ( n g à y ) PP1 PP2 PP3 Phương pháp
Biểu đồ 4.4: Thời gian nuôi cấy ở 3 phương pháp
Thời gian nuôi cấy của 3 phương pháp chỉ kéo dài từ 10,0-11,6 ngày, đây là kết quả có thể chấp nhận được; đặc biệt với phương pháp 2 và 3, thời gian nuôi cấy khoảng 10 ngày là dấu hiệu rất khả quan. So với kết quả của tác giả Bùi Võ Minh Hồng (2005) thì thời gian ni cấy của phương pháp 1 ở nghiên cứu này tốt hơn, dù lượng dịch ối mà tác giả sử dụng là nhiều hơn (3ml/bình cấy flask so với 2ml/bình cấy flask trong nghiên cứu này). Nghiên cứu của tác giả Bùi Võ Minh
Hoàng cho thấy thời gian nuôi cấy khi dùng 0,5ml dịch ối sau ly tâm nuôi trong 4ml môi trường là 10 -12 ngày đối với tuổi thai 15 - 20 tuần, 12 - 18 ngày đối với tuổi thai 21 - 24 tuần và 13 - 19 ngày đối với tuổi thai 25 tuần; khi dùng 2ml dịch ối sau ly tâm nuôi trong 2ml môi trường, thời gian nuôi cấy là 9-12 ngày đối với tuổi thai 15 - 20 tuần, 10 - 15 ngày đối với tuổi thai 21 - 24 tuần và 12 - 18 ngày đối với tuổi thai ≥ 25 tuần [3].
Thời gian nuôi cấy ở phương pháp 3 trong nghiên cứu này có dài hơn so với một số nghiên cứu trên thế giới, ví dụ nghiên cứu của Hecht và cộng sự (1981) nuôi cấy 1429 mẫu dịch ối trên lá kính, trong 329 trường hợp nuôi cấy cuối, thời gian thu hoạch là 8,7 ngày [18]; nghiên cứu của Kuligowski (1999) ni cấy in situ trên lá
kính trong đĩa petri 35mm với môi trường AmnioMax C-100 và AmnioMax-II Complete, thu hoạch sau 6 ngày đều cho kết quả rất tốt về số cụm tế bào và cụm NST kỳ giữa [24]; Raddatz (2005) nuôi cấy dịch ối in situ trên lá kính 30mm đặt trong đĩa petri 35mm khi dùng AmnioMax có thời gian ni cấy là 8,45±2,1 ngày [53]. Tuy nhiên, do lượng dịch ối/đĩa petri sử dụng cho các nghiên cứu của các tác giả trên đều lớn hơn thể tích dịch ối dùng trong nghiên cứu này, thêm vào đó kích thước lá kính dùng để ni cấy được sử dụng có sự khác biệt nên không thể loại trừ ảnh hưởng của chúng này đến thời gian thu hoạch.
Xét phương pháp 2, thời gian thu hoạch trong nghiên cứu này ngắn hơn 1 ngày so với nghiên cứu của Chang (1982) khi nuôi cấy với môi trường SF, môi trường H và môi trường H-I dù lượng dịch ối của tác giả là 6-10 ml, lớn hơn 3-5 lần của nghiên cứu này [13].
(a)
(b)
Hình 4.5: Một số mẫu thu hoạch của phương pháp 2 (a) và phương pháp 3 (b)
Từ những nhận định trên cho thấy, nếu xét trên khía cạnh phương tiện khoa học kỹ thuật ở Việt Nam đang ngày càng được hiện đại hóa, chất lượng hóa chất ni cấy càng tốt và trình độ kỹ thuật của kỹ thuật viên ngày càng nâng cao, thì hiệu quả việc nuôi cấy trong ứng dụng thực tế sẽ cịn cao hơn kết quả ni cấy được trình bày ở đây rất nhiều.
Tóm lại, phương pháp ni cấy được sử dụng có ảnh hưởng đến hiệu quả nuôi cấy thông qua tỷ lệ các mẫu nuôi cấy thành công hay thất bại ở mỗi quy trình, cũng
như thể hiện qua thời gian nuôi cấy (P<0,05). Trong đó phương pháp 2 thể hiện nhiều ưu điểm hơn 2 phương pháp còn lại, cụ thể:
- Phương pháp 2 có tỷ lệ nuôi cấy thành công cao nhất, tiếp đến là phương pháp 1, tuy nhiên mức chênh lệch giữa 2 phương pháp này không đáng kể. Tỷ lệ thành công đạt thấp nhất ở phương pháp 3.
- Tỷ lệ các mẫu của phương pháp 1 và 2 bám, tạo cụm và đạt mức phát triển (+), (++) cao hơn của phương pháp 3.
- Hầu hết các mẫu ni cấy có tế bào bám và tạo cụm chỉ sau khi cấy ≤5 ngày sau, trong đó tỷ lệ cao nhất ở phương pháp 2, tiếp đến là phương pháp 1, đều cao hơn phương pháp 3. Tuy nhiên sự khác biệt của kết quả này ở 3 phương pháp khơng có ý nghĩa thống kê.
- Thời gian cần thiết để phát triển đến mức (++) ở phương pháp 1 và 2 tương đối đồng đều và tốt hơn ở phương pháp 3.
- Trung bình tổng thời gian nuôi cấy của phương pháp 2 và 3 khoảng 10-10,4 ngày, ngắn hơn 1,2-1,6 ngày so với phương pháp 1.
Một ưu điểm cũng cần đề cập đến là tính kinh tế khi sử dụng các phương pháp nuôi cấy này. Nuôi cấy và thu hoạch tế bào ối nuôi cấy bằng phương pháp 2 và 3 tiết kiệm hóa chất và thời gian rất nhiều so với phương pháp 1. Với phương pháp 2, khi nuôi cấy cần tổng thể tích mơi trường là 6ml, với phương pháp 3 cần 7ml, đều ít hơn nhiều so với phương pháp 1 (cần 12ml). Thể tích demecolcine sử dụng cho thu hoạch tế bào nuôi cấy bằng phương pháp 2 và 3 bằng ½ so với phương pháp 1, ngồi ra trong q trình thu hoạch không cần sử dụng trypsin EDTA 0,05%. Do không cần xử lý làm bong tế bào, không cần trải tế bào lên phiến kính nên quy trình thu hoạch tế bào in situ của phương pháp 2 và 3 cũng đơn giản và tiết kiệm 50% thời gian so với phương pháp 1.