KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.2.1. Ảnh hưởng của liều lượng demecolcine và thời gian ủ với này lên chất lượng cụm NST quan sát (thử nghiệm 2.1)
lượng cụm NST quan sát (thử nghiệm 2.1)
Liều lượng demecolcine và thời gian xử lý mẫu với chất này đều ảnh hưởng lên chất lượng tiêu bản NST, ngồi ra có sự tương tác của 2 yếu tố này lên kết quả ở thử nghiệm 2.1 (P<0,05). Do đó, kết quả được nhận xét ở mỗi liều lượng trong từng mức thời gian.
Có tổng cộng 740 cụm NST được quan sát, kết quả được thể hiện trong 2 bảng 4.9 và 4.10. Kết quả từ bảng 4.9 nếu xét chung cho tất cả 16 lô, số cụm trung bình đạt được là 2,3 cụm/quang trường, đạt mức trung bình. Kết quả này bằng với số cụm trung bình của nội dung nghiên cứu 1 khi thu hoạch sơ bộ. Với thể tích dịch ối sử dụng ni cấy là 2ml/bình cấy flask, chỉ bằng 1/3-1/5 so với thể tích thơng thường được sử dụng trong ni cấy dịch ối, thì chỉ số cụm NST thu được ở đây là khá tốt.
Trong 16 lô của thử nghiệm 2.1, 10 lơ có chỉ số cụm NST loại trung bình, trong đó có lơ đối chứng (lơ xử lý với liều 0,25µg/ml trong 60 phút, đây là điều kiện xử lý thu hoạch được sử dụng tại phịng thí nghiệm Khoa Di truyền bệnh viện Từ
Dũ, Tp HCM, được chọn làm lô đối chứng). Số cịn lại có ít cụm NST, khơng có mẫu nào có nhiều cụm NST.
Kết quả ban đầu cũng cho thấy nhiều lơ xử lý với liều 0,25µg/ml cho số cụm tốt, trong số đó, chỉ số cụm NST cao nhất là 5 cụm/quang trường thu được từ lô xử lý mẫu trong 120 phút, kế đến 4,3 cụm/quang trường từ lô xử lý trong 60 phút (lô đối chứng). Tuy nhiên sự chênh lệch giữa các kết quả này không ý nghĩa thống kê.
Bảng 4.9: Số cụm NST trung bình trong một quang trường của các lơ thí nghiệm
Thời gian
(phút)
Liều lượng (µg/ml)
Trung bình theo thời gian
0,125 0,25 0,375 0,5 N X ± SD N X ± SD N X ± SD N X ± SD N X ± SD 30 71 3,6a±1,3 47 2,4d±0,9 29 1,5f±0,7 40 2,0j±0,9 187 2,3M±1,2 60 69 3,5a±1,2 86 4,3a±1,6* 44 2,2g±1,4 8 0,4k±0,5 207 2,6 N ±1,9 90 40 2,0b±1,1 59 3,0e±1,1 25 1,3h±0,6 34 1,7l±0,7 158 2,0 P ±1,1 120 25 1,3c±0,4 99 5,0a±1,5 24 1,2i±0,4 40 2,0m±1,3 188 2,4 Q ±1,9 Trung bình theo liều lượng 205 2,6A±1,4 291 3,6B±1,7 122 1,5D±0,9 122 1,2E±1,1 740 2,3±1,6
(*: lô đối chứng. Các mẫu tự in thường biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa giữa các giá trị so với lô đối chứng, PL x tg <0,05. Các mẫu tự M, N, P, Q biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa của các giá trị theo cột, PL<0,05. Các mẫu tự A, B, D, E biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa của các giá trị theo hàng, Ptg<0,05)
Bên cạnh đó ở liều 0,125µg/ml khi xử lý với thời gian từ 30 - 60 phút cho kết quả tương đương nhau và khá tốt so với khi xử lý với thời gian dài (≥90 phút). Hai lô xử lý trong 30 và 60 phút có chỉ số cụm lần lượt 3,6 cụm và 3,5 cụm/quang trường, trong khi 2 lô xử lý với 90 và 120 phút đều cho ít cụm NST, số cụm trung bình ≤2.
Với liều ≥0,375 µg/ml ở bất cứ khoảng thời gian nào trong 4 mức được chọn đều cho số cụm NST thấp (≤2,2), thấp nhất là lô xử lý với 0,5 µg/ml trong 60 phút chỉ có trung bình 0,4 cụm/quang trường.
3.6 2.4 2.4 1.5 2 3.5 4.3 2.2 1.4 2 3 1.3 1.7 1.3 5 1.2 2 0 1 2 3 4 5 6 0,125 0,25 0,375 0,5
Liều lượng demecolcine μg/ml
S ố c ụ m 30ph 60ph 90ph 120ph
Biểu đồ 4.7: Số cụm NST trung bình của các lô theo liều lượng demecolcine và thời gian xử lý với chất này
Xét riêng theo nhóm chỉ dựa vào điều kiện liều lượng demecolcine, số cụm trung bình của các nhóm có sự khác biệt. Ở nhóm xử lý với liều 0,25µg/ml cho kết quả cao nhất với 3,6 cụm/quang trường, tiếp đến là nhóm xử lý bằng liều 0,125µg/ml (2,6 cụm/quang trường), cả 2 chỉ số cụm này được đánh giá thuộc loại
trung bình. Hai nhóm cịn lại đều có ít cụm NST, trong đó, thấp nhất là nhóm xử lý bằng liều 0,5 µg/ml với 1,2 cụm/quang trường.
Một số nghiên cứu gần đây cho thấy colcemid có thể tác động theo 2 cách tùy thuộc nồng độ. Theo Jordan (2004), colcemid ở nồng độ rất thấp sẽ liên kết với cực vi ống, ngăn chặn động học vi ống [22] do đó liên quan đến khả năng nó ngăn cản sự trùng hợp các nhị hợp tubulin tạo thoi vô sắc, nên làm tăng số cụm tế bào kỳ giữa. Yang (2010) khẳng định ở nồng độ cao, colcemid có thể kích thích tháo gỡ cực mang điện âm của vi ống nên gây giải trùng hợp theo thời gian và hại cho tế bào [50]. Có thể đó là lý do trong giới hạn liều demecolcine nhỏ hơn 0,25µg/ml, nếu tăng liều demecolcine thì số cụm NST tăng, nhưng khi tăng ≥ 0,375 µg/ml, số cụm NST giảm.
Kết quả tiếp tục được xem xét theo thời gian xử lý với demecolcine. Số cụm NST tăng nhẹ khi xử lý ở mức thời gian 60 phút (2,6 cụm/quang trường) so với mức 30 phút với 2,3 cụm/quang trường, sau đó số cụm giảm nhẹ khi xử lý với 90 phút rồi lại tăng lên khi thời gian xử lý là 120 phút. Cả 4 chỉ số cụm đều thuộc mức trung bình.
Giải thích cho khuynh hướng biến đổi của số cụm NST trong khoảng thời gian xử lý dưới 60 phút trong thử nghiệm này có thể là do thời gian từ 30 đến 60 phút tần số colcemid tạo liên kết với tubulin tăng dần. Như thế, điều này có thể làm tăng tác dụng ức chế quá trình trùng hợp tạo vi ống của demecolcine và vì vậy ức chế sự tạo thành thoi phân bào, kết quả là tăng số tế bào bị ngừng ở kỳ giữa nguyên phân. Thật vậy, kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Ray và cộng sự (1984) vì tác giả đã xác định liên kết của colcemid với tubulin cần khoảng 45 phút để đạt trạng thái cân bằng [36].
Tuy nhiên chiều hướng giảm nhẹ số cụm ở thời gian 90 phút vẫn chưa có lời giải thích đầy đủ. Có thể do tính khơng đáp ứng của tế bào đối với demecolcine [28]. Vì vậy, lượng lớn tế bào bước vào nguyên phân trong khoảng 90 phút hoàn tất việc
phân bào, dẫn đến số tế bào kỳ giữa còn lại bị giảm nhẹ. Đối với mức thời gian 120 phút, các tế bào bước vào kỳ giữa tăng lên đồng thời chúng lại khơng thể hồn tất việc phân chia nên số cụm NST kỳ giữa thu được tăng lên. Tuy nhiên do số lượng mẫu thí nghiệm trong thử nghiệm 2.1 này chưa đủ lớn nên để có được những nhận định chính xác hơn cần có những nghiên cứu đầy đủ hơn.
Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, các nghiên cứu tế bào ối chủ yếu tập trung vào khảo sát q trình ni cấy để thu nhận lượng lớn tế bào của phôi hoặc nhằm thu nhận tế bào gốc, do đó có ít cơ sở lý thuyết so sánh kết quả nghiên cứu của nội dung 2 này. Trong số ít các nghiên cứu có đề cập đến kết quả nuôi cấy và xử lý tế bào ối ở Việt Nam là nghiên cứu của Bùi Võ Minh Hoàng (2005), khi tác giả xử lý dịch ối nuôi cấy với colchicine (10 µg/ml) trong 15 phút cho 24/38 (63%) mẫu có chỉ số cụm NST loại trung bình trở lên (trong đó 7/38 chiếm 18,4% loại nhiều), khi xử lý với colcemid (10 µg/ml) trong 1 giờ tỷ lệ này lên đến 34/38 (89,5%, trong đó loại nhiều là 9/38 chiếm 23,7%) [3]. Tuy nhiên trong báo cáo này khơng đề cập cụ thể thể tích colchicine và colcemid sử dụng nên không thể so sánh.
Độ bung của NST cũng là chỉ tiêu được quan sát trong thử nghiệm này. Tiêu chuẩn đánh giá độ bung của NST được tham khảo theo Raddatz (2005), tuy nhiên các tiêu chuẩn này được áp dụng khi nuôi cấy trên lá kính trong đĩa petri và thu hoạch tại chỗ, nên khi áp dụng trong đánh giá kết quả nội dung nghiên cứu này có một số điểm khơng phù hợp. Dựa trên các thu hoạch thử nghiệm, tiêu chuẩn đánh giá độ bung được sử dụng trong phần này có một số thay đổi so với tiêu chuẩn của Raddatz.
Hình 4.6: Các tế bào ở giai đoạn khác nhau trong quá trình phân bào
A: tế bào kỳ giữa, NST còn nằm trong màng tế bào; B: tế bào ở kỳ trung gian; C: tế bào kỳ giữa, các NST chồng chéo nhau (độ bung mức +); D: tế bào đã phân
chia nhân, nhưng tế bào chất chưa phân chia (200x)
Hình 4.7: Các tế bào có bộ NST ở trạng thái khác nhau
A: tế bào ở kỳ trung gian; B: bộ NST đã co xoắn, NST dạng sợi dài, chưa có
hình dạng đặc trưng, màng nhân đã biến mất; C: NST xoắn chặt hơn của tế bào B
A D D C B A B C D A
nhưng chưa đạt độ xoắn cực đại; D: bộ NST co xoắn mức độ cao hơn tế bào C, NST
gối lên nhau ở nhiều vị trí, độ bung mức + (200x)
Độ bung của NST thể hiện qua mức độ gối lên nhau của các NST trong cụm, nó chịu ảnh hưởng của độ co xoắn của NST. Trong đó, độ co xoắn của NST phụ thuộc thời điểm mà tế bào bị ngừng trong chu kỳ tế bào do demecolcine. Kết quả cho thấy liều lượng demecolcine và thời gian ủ với chất này không ảnh hưởng đến độ bung của các cụm NST ở các lơ thí nghiệm, cũng như khơng có sự tương tác giữa hai yếu tố trên lên độ bung của cụm NST.
Xét chung, 16 lơ có 24% cụm đạt độ bung mức ++ trở lên, trong đó mức +++ là 3,8%. Trong số các lơ thí nghiệm, lơ có tỷ lệ cụm đạt độ bung tốt nhất là lô xử lý với liều 0,125µg/ml trong 60 phút (71% đạt mức ++ trở lên, trong đó 23,2% đạt mức +++). Kế đến ngay sau đó là lơ xử lý với liều 0,125µg/ml trong 120 phút (72% đạt mức ++ trở lên, trong đó 16% đạt mức +++), và đứng thứ ba là lô xử lý bằng liều 0,25µg/ml trong 90 phút (40,7% đạt mức ++ trở lên, trong đó 10,2% đạt mức +++), đều tốt hơn lơ đối chứng (0,25µg/ml – 60 phút). Các lơ xử lý với liều ≥ 0,375 µg/ml đều cho tỷ lệ các cụm NST độ bung mức +++ và ++ dưới 21%. Tuy nhiên, khơng có sự chênh lệch ý nghĩa giữa các tỷ lệ.
Bảng 4.10: Phân bố (%) cụm NST theo độ bung ở các lơ thí nghiệm
Thời gian
(phút)
Độ bung
Liều lượng (µg/ml) Trung bình theo thời gian 0,125 0,25 0,375 0,5 30 +++ 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 30 ++ 19,7 40,4 6,9 15,0 17,1 30 + 80,3 59,6 93,1 85,0 82,9
60 +++ 23,2 0,0* 2,3 0,0 8,260 ++ 47,8 37,2* 9,1 12,5 33,8 60 ++ 47,8 37,2* 9,1 12,5 33,8 60 + 29,0 62,8* 88,6 87,5 58,0 90 +++ 2,5 10,2 0,0 0,0 4,4 90 ++ 20,0 30,5 20,0 11,8 22,2 90 + 77,5 59,3 80,0 88,2 73,4 120 +++ 16.0 0,0 0,0 0,0 2,1 120 ++ 56,0 11,1 20,8 12,5 18,6 120 + 28,0 88,9 79,.2 87,5 79,3 Trung bình theo liều lượng +++ 10,2 2,1 0,8 0,0 3,8 ++ 29,2 27,5 13,1 13,1 23,2 + 60,5 70,4 86,1 86,9 73,0 (* lô đối chứng, P<0,05)
Nếu xét độ bung các NST theo liều lượng demecolcine sử dụng, kết quả cho thấy liều 0,125µg/ml cho kết quả tốt nhất với tỷ lệ cụm bung mức ++ trở lên là 39,5%, trong đó số cụm đạt mức +++ là 10,2%; kế đến là 0,25µg/ml với 29,6% mẫu đạt mức ++ trở lên. Hai liều 0,375 µg/ml và 0,5 µg/ml cho kết quả tương đương và thấp hơn 2 nhóm trên với <14% mẫu đạt độ bung mức +++ và ++. Mặc dù vậy, sự khác biệt giữa các tỷ lệ không ý nghĩa. Như vậy liều lượng demecolcine sử dụng tăng không làm tăng độ bung của các cụm NST. Cho đến nay cơ chế tác động cũng như ảnh hưởng của demecolcine lên độ bung của NST vẫn chưa được biết.
Xét theo thời gian xử lý demecolcine cho thấy khi xử lý với 60 phút cho kết quả độ bung tốt nhất với 42% số cụm đạt độ bung ++ trở lên, trong đó 8,2% đạt mức +++. Khi xử lý với 90 và 120 phút cho kết quả tương đương nhau, đều có >20% mẫu đạt mức ++ trở lên. Mức 30 phút cho kết quả thấp nhất với 82,9% mẫu bung mức +, và khơng có mẫu nào bung cấp +++. Có lẽ do thời gian 30 phút chưa đủ để demecolcine tác động lên số lượng lớn tế bào để đồng bộ hóa chúng ở kỳ giữa. Khi thời gian ủ tăng lên, số tế bào được demecolcine tác động cũng tăng lên. Điều này phù hợp với nhận định đã đề cập ở trên về thời gian để demecolcine liên kết tubulin đạt được độ cân bằng là khoảng 45 phút (Ray, 1984) [36]. Mặc dù vậy, sự khác biệt giữa các tỷ lệ cũng khơng có ý nghĩa. Điều này, có thể do cở mẫu của thử nghiệm nhỏ. Ngoài ra, độ bung của NST trong cụm còn phụ thuộc mức độ thành thạo trong các thao tác của kỹ thuật viên khi thu hoạch tế bào ối và các điều kiện như nhiệt độ xung quanh, độ ẩm tương đối và dịng khơng khí [41], [54].
Hình 4.8: Bộ NST vẫn còn tế bào chất tạo lớp mờ bao bọc bộ NST và độ bung mức + (200x)
Hình 4.9: Hai cụm NST có độ bung mức ++ (cụm A) và mức +++ (cụm B) (200x) (A) (B) A B
Hình 4.10: Bộ NST có độ bung mức +++ (A) và NST đồ tương ứng (B) (200x)
Vậy, thử nghiệm 2.1 cho thấy xử lý thu hoạch các tế bào ối bằng liều demecolcine lớn không làm tăng số cụm NST trung bình/quang trường và tác động của thời gian xử lý với demecolcine thể hiện không rõ rệt đối với 2 chỉ tiêu quan sát. Cụ thể:
- Xét chung cho 16 lô, số cụm trung bình là 2,3 cụm/quang trường, đạt mức trung bình.
- Nhiều lơ xử lý với liều 0,5 µg/ml demecolcine cho nhiều cụm NST, số cụm NST cao nhất là 5 cụm/quang trường thu được từ lô xử lý trong 120 phút.
- Liều ≥ 0,375 µg/ml ở 4 mức thời gian được chọn đều cho chỉ số cụm NST thấp, và ở liều 0,125µg/ml xử lý với thời gian dài (≥90 phút) cũng cho ít cụm NST.
- Xét chung ở 16 lô, tỷ lệ cụm đạt độ bung mức ++ trở lên khá đạt yêu cầu - Trong số các lơ thí nghiệm, lơ có cụm đạt độ bung tốt nhất là lơ xử lý với 0,125µg/ml trong 60 phút. Các lơ xử lý với liều ≥ 0,375 µg/ml đều cho tỷ lệ rất thấp các cụm NST bung mức +++ và ++. Mặc dù vậy, sự chênh lệch giữa các tỷ lệ khơng có ý nghĩa thống kê.
- Xét theo liều demecolcine sử dụng, nhóm xử lý với liều 0,25µg/ml cho số cụm cao nhất, tiếp đến là liều 0,25µg/ml. Về độ bung, nhóm có liều 0,125µg/ml cho độ bung tốt nhất. Hai liều 0,375 µg/ml và 0,5 µg/ml cho kết quả thấp về số cụm NST và độ bung.
- Xét theo thời gian xử lý, số cụm NST tăng nhẹ khi xử lý ở mức thời gian 60 phút so với 30 phút, số cụm giảm nhẹ khi xử lý với 90 phút rồi lại tăng lên khi xử lý 120 phút. Bên cạnh đó, nhóm xử lý với 60 phút cho độ bung tốt nhất, 30 phút cho kết quả thấp nhất.