Qui trình Giai đoạn Chành trụi
(%) YUNLU103-1B (%) LUYIN46 (%) LP-5M (%) IR80416-B-152-4 (%) Phòng Bệnh học phân tử (I) Chọn lọc 1 50 ± 2,04 20,33 ± 1,67 15,53 ± 1,78 19,39 ± 1,57 21,53 ± 1,98 Chọn lọc 2 38 ± 1,53 5,26 ± 1,01 2,34 ± 0,67 4,33 ± 0,51 6,21 ± 0,62 Tái sinh 27,67 ± 1,62 0 0 0 0 PCR* 15,33 ± 1,12 Rahman (2011) (II) Chọn lọc 1 55,05 ± 2,08 20,13 ± 1,67 10,53 ± 1,75 17,32 ± 1,59 11,06 ± 2,01 Chọn lọc 2 15,12 ± 1,45 7,05 ± 1,78 1,12 ± 1,98 3,54 ± 1,91 4,57 ± 1,81 Tái sinh 0 0 0 0 PCR* Hiei (2008) (III) Chọn lọc 1 40 ± 1,04 20,33 ± 1,64 15,53 ± 1,45 19,39 ± 1,87 9,34 ± 2,31 Chọn lọc 2 15,24 ± 2,12 5,19 ± 1,54 4,31 ± 1,37 8,03 ± 1,68 3,47 ± 1,38 Tái sinh 0 0 0 0 0 PCR* 0
Mặc dù có khả năng tạo callus và tái sinh tốt nhƣng cả 4/5 giớng lúa này đều khơng có khả năng tiếp nhận gen lạ hoặc có thể nhận gen lạ nhƣng tỷ lệ tái sinh rất thấp và đặc biệt khi chuyển sang môi trƣờng chọn lọc thƣ́ cấp tất cả các callus đều chết sau 2 tuần nuôi cấy (Bảng 3.5). Ngoại trừ giống lúa Chành trụi có khả năng nhận gen lạ với tỷ lệ hơn 10%, cả 4 giống lúa kể trên đều cho thấy khả năng nhận gen rất thấp trên tất cả các quy trình v à khơng có khả năng duy trì để tạo thành chồi tái sinh trên mô i trƣờng chọn lọc thƣ́ cấp (Bảng 3.5, Hình 3.15). Nguyên nhân ở đây có thể do callus đƣợc t ạo ra có thành quá dày, điều này cũng đƣợc quan sát thấy trên các giống lúa châu Phi hoặc các giống lúa khác không phải japonica [101]
Tƣ̀ kết quả kh ảo sát khả năng tiế p nhận gen cho cả 5 giống lúa chúng tôi nhận thấy chỉ có giớng lúa Chành Trụi có khả năng tiếp nhận gen lạ cho tỷ lệ tái sinh cao và ổn định nên quy trình này (Hình 3.16 và Hình 3.17 ) đã đƣợc lƣ̣a chọn để thƣ̣ c hiện trong các thí nghiệm chuyển gen tiếp theo . Quy trình này cho phép chúng tôi thực hiện thao tác chuyển gen một cách ổn định , đáng tin cậy và tạo điều kiện thuận lợi cho phép khảo sát cùng lúc các cấu trúc chuyển gen khác nhau trên giống lúa Chành Trụi.
Hình 3.16 | Quy trình chuyển gen giống Chành trụi sử dụng nền mơi trƣờng MS
Quy trình được thiết lập thích hợp cho giống Chành trụi về thời gian từng bước, nồng độ các chất bổ sung, nhiệt độ. Chú ý: nồng độ vi khuẩn A. tumefaciens cần sử dụng là OD600 = 0,1; bước ra rễ (7) có thể sử dụng mơi trường MS giảm một nửa nồng độ (MS/2) giúp rễ xuất hiện sớm (rễ mảnh và phân chia nhiều hơn), tuy nhiên ở bước tiếp theo (8) cần chú ý khi đưa cây ra vào mùa hè (khó kiểm sốt độ ẩm và nhiệt độ). Cây sau khi đưa ra nhà lưới 03 tuần sẽ được thu mẫu lá, tách DNA tổng số để sàng lọc bằng PCR xác định cây dương
Hình 3.17 | Hình ảnh tƣ liệu hóa các bƣớc trong quy trình chuyển gen vào giống lúa Chành Trụi
Ghi chú: A. Callus được hình thành; B. Callus được nhiễm Agrobacterium và đặt hạt trên
môi trường đồng nuôi cấy sau 3 ngày; C. Callus trên môi trường chọn lọc I ; D. Callus chuyển gen trên môi trường tái sinh I, II và III; E. Cây chuyển gen trên môi trường ra rễ; F. Cây chuyển gen được đưa ra cốc trong phịng thí nghiệm; G. Cây chuyển gen sinh trưởng trong chậu tại nhà lưới.
3.3. TẠO GIỐNG LÚA CHÀNH TRỤI CHUYỂN GEN
3.3.1. Biến nạp trình tự mã hóa OsDREB1A/OsDREB2A vào lúa Chành
trụi
Quy trình chuyển gen đã đƣợ c tới ƣu trong mục 3.2.3 và Hình 3.16 đã đƣợc chúng tôi sƣ̉ dụng để đƣa các cấu trúc chƣ́a trình tƣ̣ mã hóa OsDREB1A
và OsDREB2A vào giống lúa Chành trụi. Kết quả đƣợc trình bày trong Bảng 3.6 cho thấy tỉ lệ tái sinh của giống lúa chuyển gen khá cao, từ 600 hạt lúa đƣợc tạo mô sẹo thu đƣợc 99 dòng lúa tái sinh thành cây.