1.3. CÁC NHÂN TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Ở
1.3.4. Nhóm nhân tố phiên mã AP2/ERF
AP2/ERF là một họ nhân tố phiên mã đặc trƣng của thực vật, với khoảng 145 thành viên ở Arabidopsis và 163 thành viên ở lúa [68, 76]. Tất cả các nhân tố phiên mã thuộc họ AP2/ERF đều có ít nhất một domain liên kết DNA bảo thủ (AP2/ERF) chứa khoảng 60 gốc axit amin, đƣợc gọi là GBD (GCC-box Binding Domain). Cấu trúc của nhân tố phiên mã họ AP2/ERF bao gồm 3 chuỗi xoắn β đối song song ở đầu N (nhận biết trình tự DNA đích) và 1 chuỗi xoắn α ở đầu C. Mỗi nhóm nhân tố phiên mã họ AP2/ERF nhận biết và liên kết với một hay một số trình tự DNA đích khác nhau trên vùng promoter của các gen đáp ứng stress, tùy thuộc vào các trình tự tín hiệu nằm ở cả đầu N và đầu C của domain liên kết DNA của nó [68, 76, 87, 89, 105]. Họ AP2/ERF đƣợc chia thành 4 phân họ chính, bao gồm AP2, RAV (related to ABI3/VP1), ERF và DREB, trong đó phân họ DREB (với khoảng 56 thành viên) đƣợc nghiên cứu nhiều nhất. Phân họ DREB đƣợc chia thành 6 nhóm nhỏ (từ A1 đến A6) và đã đƣợc xác định có liên quan đặc biệt tới các đáp ứng chống chịu stress môi trƣờng của thực vật nhờ khả năng nhận biết và liên kết với yếu tố
cis nhƣ DRE, CRT, LTRE hay GCC-box có trong trình tự promoter của nhiều
gen đáp ứng stress hạn, mặn, lạnh và nóng [5, 68, 76, 105].
Phân họ các nhân tố phiên mã DREB A1 bao gồm 6 thành viên, trong đó các nhân tố DREB1A, DREB1B và DREB1C đƣợc xác định cảm ứng với
stress lạnh, DREB1D cảm ứng với điều kiện hạn và ABA, DREB1E và DREB1F đƣợc biểu hiện trong nồng độ muối cao [76]. Một số nghiên cứu đã chứng minh các nhân tố phiên mã nhóm DREB1 có khả năng tăng cƣờng sức chống chịu hạn của cây lúa chuyển gen. Biểu hiện của DREB1A dƣới sự điều
khiển của một promoter cảm ứng stress đã cải thiện đặc tính trổ bơng, giúp tăng sản lƣợng thu hoạch trong điều kiện hạn của dòng lúa chuyển gen so với dòng đối chứng [43]. Nhóm DREB A2 có 8 thành viên, trong đó đƣợc nghiên cứu nhiều nhất là DREB2A và DREB2B. Cả hai nhân tố phiên mã này đều đƣợc điều hòa biểu hiện rất mạnh trong điều kiện stress (hạn, mặn và lạnh) theo con đƣờng không phụ thuộc ABA [52, 67]. Cây lúa chuyển gen biểu hiện tăng cƣờng OsDREB2A cũng có tỉ lệ sống sót cao hơn so với cây đối chứng
trong điều kiện hạn và mặn [12, 26, 30, 66, 115, 116].
Nhân tố phiên mã thuộc các nhóm DREB mặc dù chƣa đƣợc nghiên cứu nhiều nhƣng cũng đã đƣợc chứng minh có liên quan tới đáp ứng stress và tăng cƣờng khả năng chống chịu stress cho cây chuyển gen. Ví dụ, biểu hiện của ABI4 (nhóm A3) dẫn tới hoạt hóa hơn 100 gen theo con đƣờng phụ thuộc ABA [33, 85]; RAP2.1 (nhóm A5) đƣợc xác định là một nhân tố ức chế phiên mã, có vai trò kiểm sốt q trình đáp ứng stress hạn và lạnh của tế bào [33]; RAP2.4 (nhóm A6) là một nhân tố hoạt hóa q trình phiên mã của các gen đáp ứng stress hạn, ánh sáng và ethylen qua trung gian là yếu tố DRE và ERE (ethylen responsive element) [18, 61, 78].
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG LÚA CHUYỂN GEN CHỊU HẠN TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM
Lúa là cây lƣơng thực quan trọng nhất, là nguồn cung cấp năng lƣợng chính cho hơn một nửa dân số thế giới, do đó sản xuất lúa gạo đƣợc chính phủ các nƣớc đặc biệt quan tâm. Tình hình sản xuất lúa gạo trong 50 năm trở lại
đây đã đạt đƣợc những kết quả to lớn nhờ ứng dụng các thành tựu của khoa học nơng nghiệp, trong đó đáng kể nhất phải nói tới 2 thành tựu: (1) nghiên cứu giảm chiều cao cây lúa những năm 1960 và (2) ứng dụng cây lúa lai vào sản xuất (1970). Tuy nhiên, trong thế kỉ mới, sản xuất lúa gạo phải đối mặt với với những thách thức to lớn: áp lực gia tăng dân số toàn cầu; giảm sút diện tích đất canh tác; từ những năm 1990 năng suất lúa đã đạt mức tối đa và có hiện tƣợng bão hồ trong thập kỷ qua, chủ yếu do đa dạng di truyền của các giống lúa bắt đầu giảm, sự phát triển của các dịch bệnh và cơn trùng trong q trình sản xuất, hiện tƣợng hạn, mặn xuất hiện trên diện rộng.
Để đối phó với thực trạng trên, một hƣớng giải quyết đƣợc chính phủ, các tổ chức xã hội và các nhà khoa học đặc biệt quan tâm đó là nghiên cứu tạo ra các giống lúa mới có năng suất cao, đồng thời có khả năng chống chịu tốt với các điều kiện bất lợi của môi trƣờng. Các nghiên cứu tạo giống truyền thống chủ yếu dựa trên các phƣơng pháp lai tạo, chọn giống thủ công nên hiệu quả đạt đƣợc không thực sự cao. Một số ứng dụng mới trong chọn giống cây trồng nhƣ dùng chỉ thị phân tử, gây đột biến... tuy đã đạt đƣợc một số kết quả nhất định nhƣng vẫn có những hạn chế nhất định. Hƣớng nghiên cứu đang đƣợc các nhà khoa học thế giới đặc biệt quan tâm là chuyển các gen quy định những tính trạng mong muốn vào lúa, từ đó tạo ra các giống lúa mang các đặc tính nhƣ mong muốn của con ngƣời. Phƣơng pháp này đã thể hiện những ƣu thế vƣợt trội so với các phƣơng pháp truyền thống và đang dần trở thành hƣớng đi chủ đạo trong chọn tạo giống cây trồng.
Việc tạo giống lúa biến đổi gen đã đƣợc nghiên cứu thực hiện từ rất sớm và đã đạt đƣợc những thành tựu đáng kể. Cuối những năm 1980, ba nhóm nghiên cứu độc lập với nhau cùng công bố đã tạo ra đƣợc cây lúa chuyển gen từ các tế bào trần đƣợc chuyển gen nhờ xung điện và PEG. Năm 1991, các nhà khoa học đã phát minh ra phƣơng pháp sử dụng súng bắn gen
để chuyển gen vào lúa và cho tới nay phƣơng pháp này vẫn đang đƣợc sử dụng rất phổ biến.
Năm 1993, Chan và cs. đã thành công trong việc chuyển gen vào lúa thông qua trung gian Agrobacterium. Hiei và cs đã phát triển hệ thống chuyển gen lúa thông qua trung gian Agrobacterium của Chan và tối ƣu thành một
quy trình chuyển gen hiệu quả cho giống lúa japonica, sử dụng callus từ hạt
lúa trƣởng thành [101]. Quy trình của Hiei sau đó đƣợc cải tiến để rút ngắn thời gian và trở thành một phƣơng pháp đƣợc sử dụng rất phổ biến để chuyển gen ngoại sinh vào giống lúa japonica. Tuy nhiên, quy trình này lại tỏ ra
không mấy hiệu quả đối với giống lúa indica [94]. Một số cải tiến của quy
trình này đã đƣợc thực hiện nhằm tăng hiệu suất chuyển gen vào giống lúa
indica [3, 11, 12, 15, 86].
Gần đây, Hiei và Komari [114] đã công bố một quy trình chuyển gen thơng qua Agrobacterium thích hợp cho cả lúa japonica và indica. Theo đó,
nếu sử dụng phơi non thì việc chuyển gen vào lúa indica chỉ mất 2,5 tháng và đạt hiệu suất rất cao (từ 1 phơi non có thể tạo ra đƣợc 5 - 13 cây chuyển gen). Tuy nhiên, việc thu phơi non phải thực hiện trong phòng thí nghiệm và bị giới hạn nhiều về thời vụ gieo trồng. Do phát triển khơng ngừng của khoa học, quy trình chuyển một gen ngoại sinh vào hệ gen của cây trồng không còn đáp ứng đƣợc yêu cầu của các nhà khoa học, vì vậy một số cơng nghệ đặc biệt đã đƣợc phát triển để phục vụ cho các mục đích nghiên cứu khác nhau nhƣ: chuyển đa gen, điều khiển sự biểu hiện của gen chuyển ở những mô nhất định hay biểu hiện trong điều kiện nhất định, chuyển gen vào lục lạp. Tuy nhiên, trong công bố khá gần đây trong sách Cereal Genomics: Methods and Protocols năm 2014,tác giả Slamet-Loedin I.H. vẫn cho rằng quy trình chuyển gen vào phơi trƣởng thành của lúa indica và japonica thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
vẫn là phƣơng pháp thông dụng và hiệu quả, vẫn đang tiếp tục đƣợc áp dụng tại nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới [118].
Cho tới nay, các gen đƣợc quan tâm nghiên cứu để chuyển vào lúa là các gen liên quan đến tính kháng sâu, gen chống chịu bệnh, gen kháng thuốc diệt cỏ, gen liên quan đến chất lƣợng gạo và năng suất, gen liên quan đến khả năng chống chịu stress (hạn, mặn...). Nhiều công bố đã chứng minh tiềm năng của hƣớng nghiên cứu tạo giống lúa chất lƣợng cao, chống chịu tốt bằng con đƣờng chuyển gen.