Trong điều kiện biến đổi khí hậu tồn cầu hiện nay, hạn hán xảy ra thƣờng xuyên và trở thành nhân tố chính gây mất mùa trên diện rộng ở hầu hết các quốc gia sản xuất lúa gạo. Do đó, việc tạo ra các giống lúa có khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trƣờng (hạn, mặn, nhiệt độ cao...) đƣợc các nhà khoa học đặc biệt quan tâm. Nhóm gen cấu trúc (gen chức năng) chủ yếu đƣợc quan tâm nhiều trong các nghiên cứu cơ bản, do cơ chế hoạt động đơn giản, dễ thực hiện. Tuy nhiên, việc sử dụng các gen này vào việc nghiên cứu tạo cây lúa chuyển gen chống chịu stress có những hạn chế nhất định, do đây đều là nhƣng tính trạng đa gen. Chính vì vậy, nhóm gen điều hòa (tham gia điều hòa hoạt động của một mạng lƣới các gen đáp ứng với điều kiện hạn, bao gồm CDPKs, CIPKs, MAPKs, nhân tố phiên mã...) đƣợc các nhà khoa học đặc biệt quan tâm bởi những tiềm năng to lớn của nó.
Hu và cs [63] đã có những cơng bố chứng minh tiềm năng to lớn của gen mã hóa nhân tố phiên mã SNAC1 trong việc chuyển gen tạo giống lúa
chịu hạn. Đây là một gen thuộc họ gen NAC (NAM, ATAF và CUC), biểu hiện mạnh ở các tế bào biểu bì lá trong điều kiện hạn hán. Cây lúa đƣợc chuyển gen SNAC1 có khả năng chịu hạn cao và tỷ lệ sống sót cao hơn cây lúa không
chuyển gen 80%. Các phân tích bằng kĩ thuật microarray đã chứng minh ở cây lúa chuyển gen SNAC1, hơn 150 gen liên quan đến đáp ứng điều kiện hạn đã đƣợc điều khiển bởi gen này.
Kết quả nghiên cứu cho thấy cây lúa chuyển gen OsNAC1, OsNAC2, OsNAC5, OsNAC10 có tính chống chịu cao hơn với điều kiện hạn và mặn
nhƣng không bị ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng phát triển. Đặc biệt, cây lúa chuyển gen OsNAC10 tăng cƣờng tính chịu hạn, mặn, đồng thời tăng năng suất từ 25% tới 45% trong điều kiện hạn [46]. Cây lúa chuyển gen OsNAC6
tăng cƣờng tính chịu hạn, mặn, lạnh, tuy nhiên khả năng sinh trƣởng kém và năng suất thấp. Đặc biệt, ngồi việc tăng cƣờng tính chống chịu với bất lợi thời tiết, cây lúa chuyển gen OsNAC6 còn tăng cƣờng tính kháng bệnh bạc lá so với cây đối chứng [73].
Bên cạnh nhóm gen NAC, nhóm gen DREB cũng đã đƣợc nghiên cứu
rộng rãi trong đáp ƣ́ng điều kiện hạn . Gen OsDREB2 của lúa đã đƣợc phân
lập và nghiên cứu đặc tính cho thấy gen này cũng cảm ứng bởi các điều kiện stress của môi trƣờng nhƣ hạn hay mặn, tuy nhiên khơng làm thay đổi kiểu hình của cây chuyển gen mơ hình Arabidopsis [52, 64]. Mới đây, các nhà
khoa học đã phân lập và chứng minh đƣợc vai trò đối với khả năng chống chịu stress của 5 gen mới thuộc nhóm DREB2 ở lúa (OsDREB2s, OsDREB2A,
OsDREB2B, OsDREB2C, OsDREB2E và OsABI4). Tuy nhiên, trong đó chỉ
có hai gen OsDREB2A và OsDREB2B cảm ứng với điều kiện stress. Sự tăng cƣờng biểu hiện của OsDREB2B làm tăng cƣờng sự biểu hiện của các gen
đích do gen OsDREB2A điều khiển, dẫn tới làm tăng tính chống chịu với hạn và shock nhiệt của cây chuyển gen. Phát hiện này chứng tỏ gen OsDREB2B là một gen rất quan trọng, mã hóa cho nhân tố phiên mã thuộc họ DREB2, có
B ản g 1 .1 | C ác n gh iê n c ứu c h u y ển ge n c h ức n ăn g t ăn g c ƣờ n g tín h ch ốn g/ch ịu h ạn ở l úa [95]
Mặc dù có rất nhiều nghiên cứu về lúa chuyển gen chịu hạn đã đƣợc công bố (Bảng 1.1) nhƣng chủ yếu các dữ liệu thu đƣợc đều chỉ ở quy mơ phòng thí nghiệm và nhà kính, hầu nhƣ rất ít nghiên cứu đƣợc thực hiện tới quy mô thử nghiệm trên đồng ruộng. Xiao và cs đã chuyển bảy gen CBF3, SOS2, NCED2, NPK1, LOSS, ZAT10 và NHX1 vào giống lúa Zhonghua 11,
đặt dƣới sự điều khiển của promoter biểu hiện liên tục Actin1 và promoter biểu hiện trong điều kiện hạn HVA22 và đã thử nghiệm tính chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen trên quy mô đồng ruộng. Kết quả thu đƣợc cho thấy: có 8 dòng lúa có tính chịu hạn cao và cho sản lƣợng cao hơn rõ rệt trong cả điều kiện thử nghiệm phòng thí nghiệm và điều kiện đồng ruộng so với cây đối chứng; 10 dòng có khả năng trổ bơng tốt hơn so với cây đối chứng trong điều kiện hạn. Khi thử nghiệm khả năng chịu hạn của các cây chuyển gen T2 và T3, Xiao và cs thu đƣợc 7 dòng lúa chuyển gen có năng suất cao hơn cây đối chứng và 9 dòng có khả năng trổ bơng tốt hơn cây đối chứng. Các kết quả thu đƣợc chứng tỏ 2 gen LOS5 và ZAT10 có hiệu quả đối với cây lúa chuyển gen cao hơn 5 gen còn lại.
Một giống lúa chịu hạn lí tƣởng phải có năng suất cao và chất lƣợng tốt trong điều kiện gieo trồng bình thƣờng, trong điều kiện hạn hán phải có năng suất cao hơn những giống lúa tốt nhất. Mặc dù các nghiên cứu chuyển các gen chức năng và gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến chịu hạn đã thu đƣợc nhiều kết quả khả quan trong việc tạo giống lúa chịu hạn. Tuy nhiên, do tính chất phức tạp của tính trạng chịu hạn vì vậy vẫn cần nhiều thời gian để có đƣợc các giống lúa chuyển gen chịu hạn thƣơng mại. Tuy nhiên thực tế đang chứng minh là sự kiện thƣơng mại hóa giống lúa chuyển gen chịu hạn chỉ là vấn đề thời gian và các nghiên cứu chuyển gen liên quan đến tính chịu hạn ở lúa ln đƣợc quan tâm, đặc biệt là các nƣớc đang phát triển sử dụng lúa gạo là nguồn lƣơng thực chính.
Suốt 2 thập kỉ vừa qua, chúng ta đã có những bƣớc phát triển vƣợt bậc trong nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen. Các nhà khoa học không chỉ thiết lập các hệ thống chuyển gen mà còn phát triển nguồn vật liệu dùng cho các nghiên cứu chuyển gen. Nhiều gen quan trọng đã đƣợc phát hiện và phân lập dựa trên thành tựu của các nghiên cứu về hệ gen của cây mơ hình (lúa và
Arabidopsis). Đây chính là nguồn vật liệu quan trọng, có tiềm năng ứng dụng
rất lớn trong nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen. Tuy nhiên, chúng ta vẫn còn nhiều vấn đề cần phải đƣợc cải tiến trong nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen:
- Trƣớc hết đó là vấn đề về cơng nghệ, việc chuyển các trình tự DNA có kích thƣớc lớn hay chuyển gen lục lạp mặc dù có tiềm năng ứng dụng rất lớn nhƣng lại chƣa đƣợc ứng dụng rộng rãi và đòi hỏi phải có những cải tiến về mặt cơng nghệ.
- Vấn đề thứ hai đó là sự khan hiếm về nguồn vật liệu để sử dụng cho các nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen. Ví dụ, đến nay chúng ta đã xác định đƣợc khá nhiều gen liên quan đến tính chịu hạn của lúa, nhƣng chƣa có gen nào thực sự có hiệu quả cao và có thể sử dụng để tạo ra giống lúa chịu hạn thƣơng mại.
- Khó khăn thứ 3 đó là đối với hƣớng nghiên cứu tạo giống mới bằng chuyển gen, rất khó để cải tiến rút ngắn đƣợc quy trình thực hiện. Ví dụ, chúng ta đã thu đƣợc những hiệu quả nhất định khi chuyển các gen ngoại sinh vào cây lúa, tuy nhiên chúng ta đều biết rằng con đƣờng để phát triển một giống lúa chuyển gen chịu hạn vẫn là một con đƣờng rất dài.
B ản g 1 .2 | Nghi ên c ứ u tạo g iốn g lú a ch u y ển ge n ch ịu h ạn t rê n t h ế giói [ 95]
- Cuối cùng, chúng ta phải nhận thức đƣợc vấn đề tạo ra một giống lúa chuyển gen thƣơng mại vẫn là rất khó khăn mặc dù chúng ta đã có một số giống cây trồng chuyển gen khác đã đƣợc thƣơng mại hóa từ 10 năm trƣớc nhƣ ngô, bông, đậu tƣơng. Thế giới vẫn còn nhiều nghi ngờ về tính an tồn của sản phẩm lúa chuyển gen vì đây là cây lƣơng thực quan trọng nhất. Những thành quả nghiên cứu sẽ khơng có giá trị nếu lúa chuyển gen khơng đƣợc đƣa vào sản xuất.
Chính vì những thách thức trên, càng ngày các nghiên cứu cơ bản về chức năng hệ gen càng đòi hỏi phải đƣợc thực hiện sâu hơn để xác định, phân lập và nghiên cứu làm rõ hơn hoạt động chức năng của các gen cũng nhƣ cơ chế sinh học của các quá trình liên quan, từ đó sử dụng làm nguồn vật liệu cho các nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen có tính chống chịu tốt, đồng thời có năng suất cao, chất lƣợng tốt [11].
1.4.2. Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen ở Việt Nam
Ở Việt Nam, hạn đƣợc xem là nguyên nhân chính làm giảm năng suất cây trồng và làm cho sản lƣợng lƣơng thực khơng ổn định. Vì vậy đã từ lâu, rất nhiều phòng thí nghiệm quan tâm đến việc chọn tạo giống chịu hạn. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu tập trung vào phƣơng pháp truyền thống nhƣ lai tạo, chọn lọc cá thể, quần thể... và kết quả là nhiều giống chịu hạn đã đƣợc áp dụng trong sản suất. Gần đây, chọn giống chịu hạn theo định hƣớng di truyền phân tử nhƣ việc sử dụng các chỉ thị phân tử, lập bản đồ QTL liên kết với một số tính trạng chịu hạn đang đƣợc các nhà khoa học Việt Nam đặc biệt quan tâm. Phòng Tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học đã lập bản đồ QTL liên kết với các tính trạng ở rễ lúa liên quan đến tính chịu hạn ở các giống vùng cao Việt Nam và gần đây đã thiết lập phƣơng pháp đánh giá tính chịu
quan đến chịu hạn của các giống lúa trồng ở Việt Nam. Viện lúa Đồng bằng Sơng Cửu Long cũng có nhiều nghiên cứu chọn tạo giống chịu hạn nhƣng tập trung chủ yếu vào việc lai tạo truyền thống và các phƣơng pháp chọn giống phân tử [9, 16, 17].
Định hƣớng chuyển gen vào lúa đã bắt đầu hình thành ở Việt Nam vào những năm 1995 của thế kỷ trƣớc và tập trung ở bốn cơ quan: (1) Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam có hai cơ sở chính là Viện Cơng nghệ sinh học và Viện Nhiệt đới, (2) Viện lúa Đồng bằng sông Cửu Long, (3) Viện Di truyền Nông nghiệp và (4) Viện cây lƣơng thực và cây Thực phẩm [3, 4, 6, 7, 8, 12, 13, 15]. Nguyễn Hữu Hổ và CS chuyển gen bằng súng bắn gen ở giống lúa thơm Nàng hƣơng chợ Đào sử dụng callus 10 ngày tuổi tạo từ hạt trƣởng thành. Nguyễn Mạnh Đôn chuyển gen SBTI vào lúa Indica. Nguyễn Thị Thanh Huyền và CS nghiên cứu ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng nuôi cấy đến tỷ lệ tạo mô sẹo và đánh giá khả năng tái sinh cây của một số giống lúa. Trần Thị Cúc Hòa và Bùi Bá Bổng đã biến nạp gen Pmi vào lúa Indica
các giống Một Bụi và MTL250 sử dụng tế bào huyền phù phơi hóa để biến nạp. Nguyễn Thị Hồng Châu và CS chuyển gen cry1Ac vào lúa Indica giống C71 sử dụng mơ sẹo tạo ra từ hạt chín để biến nạp với hiệu quả biến nạp đạt 6,6%. Trần Thị Cúc Hòa và CS sử dụng Agrobacterium mang vector pUBB-
Man chứa gen cry1Ac và cry1Ab, biến nạp vào phôi non của giống lúa IR64
(hiệu suất 1-2,4%) và K105 (0,79-3,33%); đối với Agrobacterium mang
vector pUBC-Man cho hiệu suất biến nạp gen 1,8-4,78% ở giống IR64, 1,81- 3,07% ở giống K105, và 5,5-5,83% ở giống Một bụi đỏ. Nguyễn Thị Hằng và CS chuyển gen TPS vào lúa Indica giống C71 tạo ra cây lúa biến nạp kháng
mặn sử dụng mơ sẹo từ hạt chín để biến nạp. Nguyễn Hữu Hổ chuyển gen cry1A(b)- cry1Ac kháng sâu đục thân vào lúa Indica giống Một bụi bằng súng
bắn gen sử dụng tế bào mô sẹo nuôi cấy huyền phù để biến nạp thu đƣợc hiệu suất chuyển gen là 1,5% [11].
Trong thời gian gần đây, việc chuyển gen từ callus của một số giống lúa vào lúa thông qua vi khuẩn Agrobacterim tumerfaciens đã thu đƣợc một
số thành cơng nhƣ nhóm nghiên cứu Việt – Pháp ở Viện Di truyền Nông nghiệp trên giống J02 và Tai chung 67 [3 và 4], nhóm nghiên cứu ở Học viện Nông nghiệp Việt Nam cũng bắt đầu thành công trên giống lúa J02. Nhìn chung các giống lúa chuyển gen thành công ở Việt Nam chủ yếu là các giống japonica, hầu nhƣ chƣa có giống lúa indica. Nhóm nghiên cứu ở Bộ môn Bệnh học Phân tử của Viện Di truyền Nông nghiệp cũng bắt đầu thành công ở giống lúa Chành Trụi là giống indica nhƣng chƣa đƣợc nghiên cứu đầy đủ [12]. Do đó nghiên cứu này sẽ đƣợc nghiên cứu sâu và đầy đủ về việc tạo dòng lúa chuyển gen ở Việt Nam.
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU VÀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Tập đoàn 46 giống lúa đƣợc cung cấp bởi Viện Khoa học kỹ thuật Nông Lâm nghiệp miền núi phía Bắc , giống lúa Chành trụi và Cƣờm dạng I đƣợc cung cấp bởi Trung tâm Tài nguyên Thực vật. Danh sách giống đƣợc trình bày ở Bảng 2.1. Các giống lúa số thứ tự từ 1 - 47 đƣợc sử dụng cho nghiên cứu phát triển hệ thống tái sinh và tiếp nhận gen lạ. Giống Cƣờm Dạng I và giống lúa Mộc Tuyền (cung cấp bởi Bộ môn Bệnh học Phân tử thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp) đƣợc sử dụng để nhân bản các trình tự mã hóa nhân tố phiên mã OsDREB1A và OsDREB2A.
Bảng 2.1 | Danh sách các giống lúa đƣợc trồng ở miền Bắc Việt Nam đƣợc sử dụng trong nghiên cứu
Số ký hiệu giống Tên giống Số ký hiệu giống Tên giống Số ký hiệu giống Tên giống 1 DR4 17 IR554321 33 YUNLU100B 2 DR5 18 LB1-2 34 YUNLU103-1B 3 IR74371-3-1-1 19 LB-2M 35 YUNLU106 4 IR74371-54-1 20 LHY-4 36 YUNLU103-2B 5 IR78878-5-1-3-3 21 LCV-8M 37 YUNLU103-2 6 IR55419-04-AO 22 GTNM 38 YUNLU105-B 7 YUNLU50 23 IR81430-B-B-94 39 YUNLU104A 8 LUYIN46 24 IR84179-B-403 40 YUNLU105 9 LC93-1* 25 IR81413-B-B-75-2 41 YU07H-34789 10 IR78878-5-1-3-1 26 IR80416-B-152-4 42 IR82870-48 11 IR78878-176-B-2-B 27 IR81040-B-87-U2-1 43 YUNLU104-B 12 IR79889-B-179-2-2 28 LP-5M 44 Nếp Khau Để Dỏn 13 IR79913-B-326B 29 IR79906-B-5-3-3 45 Nếp Khau Pí Pột 14 IR78875-131-B-1-4 30 YUNLU69 46 LC93-4
15 IR79913-B-176-4 31 YUNLU65 47 Chành Trụi 16 CIRAD141 32 YUNLU100A 48 Cƣờm Dạng I
49 Mộc Tuyền
* Nhóm phụ japonica; cịn lại: nhóm indica (nguồn: Viện KHKT Nơng Lâm nghiệp miền núi phía Bắc và Trung tâm Tài nguyên Thức vật, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam.
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu
2.1.2.1. Các chủng vi sinh vật
Chủng vi khuẩn E. coli DH5α, chủng vi khuẩn A. tumefaciens LBA
4404, EHA 105 do Bộ môn Bệnh học phân tử, viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp.
2.1.2.2. Các vector và primer
Bảng 2.2 | Trình tự các primer (oligo-nucleotide) sử dụng trong nghiên cứu
Tên oligo Trình tự Gen/vector
OsDREB1A-Fv 5’-GAGGATCCATGTGCGGGATCA-3’ OsDREB1A
OsDREB1A-Rw 5’-GAGGATCCTAGTAGCTCCAGAG-3 OsDREB1A
OsDREB1A-Fwt 5’-GACGACGACGAGGAGTCCGC-3’ OsDREB1A
pUC19-Rv 5’-TATTTAGGTGACACTATAG-3’ pUC19
pUC19-Fw 5’-CAGCTATGACCATGATTACGC-3’ pUC19
OsDREB2A-Rv 5’-ATGGATCCCTAATAGGAGAAAAG-3’ OsDREB2A
OsDREB2A-Fw 5’-ATGGATCCATGGAGCGGGGGGAG-3’ OsDREB2A
OsDREB2A-Fwt 5’-CGTGTAGTCCCTGAGGTGCAGG-3’ OsDREB2A
OsDREB2A-Fw-P 5’-GAGGCGACGCAGATCTGAAC-3’ OsDREB2A
OsDREB2A-Rv-P 5’-ACCCGCAGCATGACTACTAC-3’ OsDREB2A
Lip9-Fw 5’-GCGAATAGTTCTTGCTGATC-3’ pBIG-Lip9 Ubi-Fw 5’-CCCTGCCTTCATACGCTATT-3’ pBIG-Ubi NosT-Fw 5’-TTGCCGGTCTTGCGATGATT-3’ pBIG-Lip9/Ubi NosT-Rv 5’-ACCGCGCGCGATAATTT-3’ pBIG-Lip9/Ubi NosT-Rvt 5’-AGACCGGCAACAGGATTCAA-3’ pBIG-Lip9/Ubi DIP1-Fw 5’-CCATGGTTGGAATTTGGAAG-3’ DIP-1
DIP1-rv 5’-CCAGCCCAAAACCAATACAA-3’ DIP-1
SALT-Fw 5’-GAGGGTCAGCTCAGGACATCA-3’ SALT
SALT-Rv 5’-AAGCGTTCCAGACCTTCCAAA-3’ SALT
Actin-Fw 5’-TGATGGTGTCAGCCACACT-3’ Actin
Actin-Rv 5’-TGGTCTTGGCAGTCTCCATT-3’ Actin
Hyg-Fw 5’-AAACTGTGATGGACGACACCGT-3’ hptII
Hyg-Rv 5’-GTGGCGATCCTGCAAGCTCC-3’ hptII
Hyg-RT-Fw 5’-CGAAGAATCTCGTGCTTTCA-3’ hptII
Hyg-RT-Rv 5’-ATGCAAAGTGCCGATAAACA-3’ hptII