Cấu trúc gen chuyển Số Callus Chọn lọc 1 Chọn lọc 2 Tái sinh
Lip9: OsDREB2A 100 75 28 15 Ubi: OsDREB2A 100 81 34 12 Lip9: OsDREB1A 100 85 33 23 Ubi: OsDREB1A 100 88 38 20 pBIG-Lip9 100 79 30 16 pBIG-Ubi 100 80 29 13 Tổng 600 488 192 99
Các cây chuyển gen dƣơng tính trƣớc khi đƣa ra bầu đất sinh trƣởng trong nhà lƣới đƣợc kiểm tra khả năng mang gen cần chuyển bằng 2 phản ứng PCR với: (1) mồi đặc hiệu của gen và vector chuyển gen; (2) mồi đặc hiệu gen hptII: Hyg-Fw và Hyg-Rv (Bảng 2.2).
3.3.2. Sàng lọc các dòng Chành Trụi chuyển gen
3.3.2.1. Sàng lọc các cây chuyển gen thế hệ T0
Các cây tái sinh đƣợc kiểm tra sự tồn tại của cấu trúc chuyển gen bằng cả hai phản ứng PCR với khuôn DNA tổng số cho mỗi cây bao gồm: (i) gen chuyển hoặc trình tự Nos-terminator (cặp mồi OsDREB1A-Fwt và NosT-Rv cho các cây biến nạp cấu trúc pBIG-Ubi:OsDREB1A/pBIG-Lip9:OsDREB1A; cặp mồi
OsDREB2A-Fwt và NosT-Rv cho các cây biến nạp cấu trúc pBIG-
Lip9:OsDREB2A/pBIG-Ubi:OsDREB2A; cặp mồi NosT-Fw/Rv cho các cây biến nạp cấu trúc pBIG-Lip9/pBIG-Ubi) và (ii) gen kháng Hygromycin (hptII) bằng cặp mồi Hyg-Fw/Rv (Bảng 2.2).
Kết quả phân tích bằng PCR (Hình 3.18, Hình 3.19) cho thấy các cấu trúc chuyển gen đã đƣợc biến nạp vào giống lúa Chành trụi ở thế hệ T0. Tỷ lệ cây lúa Chành trụi chuyển gen cho kết quả dƣơng tính với cả hai phản ứng PCR đạt 70/99 xấp xỉ 70,76% trên tổng số cây kiểm tra (Bảng 3.7). Kết quả này là tƣơng đƣơng so với các nghiên cứu tƣơng tự tại Việt Nam [8 và 9] và trên thế giới. Các cây biến nạp các cấu trúc pBIG-Lip9/Ubi:OsDREB1A hoặc pBIG- Lip9/Ubi:OsDREB2A dƣơng tính với cả hai phản ứng PCR đã đƣợc tiếp tục phân tích bằng PCR định lƣợng (qRT-PCR) sử dụng SYBR green là chất nhuộm huỳnh quang với khuôn là DNA tổng số nhƣ miêu tả trong mục 2.2.9 nhằm ƣớc tính số lƣợng bản copy của cấu trúc chuyển gen với các cặp mồi tƣơng ứng là Hyg-RT-Fw và Hyg-Rv cho cấu trúc chuyển gen (Bảng 2.2) và cặp mồi cho gen REF#3 là gen đơn bản trong hệ gen của lúa.
Hình 3.18 | Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra cây Chành trụi chuyển gen
Ghi chú: A- Sản phẩm PCR với cây Chành trụi biến nạp vector trống pBIG-Lip9 sử dụng
cặp mồi Lip9-Fw và NosT-Fwt; B-Sản phẩm PCR với cây Chành trụi biến nạp vector
trống pBIG-Ubi sử dụng cặp mồi Ubi-Fw và NosT-Fwt; C- Sản phẩm PCR với cây Chành trụi biến nạp cấu trúc pBIG-Lip9:OsDREB2A sử dụng cặp mồi OsDREB2A-Fwt và NosT- Fwt; D & E- Sản phẩm PCR với cây Chành trụi biến nạp cấu trúc pBIG-Lip9:OsDREB1A và pBIG-Ubi:OsDREB1A sử dụng cặp mồi OsDREB1A-Fwt và NosT-Fwt; M: thang chuẩn 1 kb; Giếng 1: đối chứng âm khơng có khn DNA; Giếng 2: đối chứng dương sử dụng
Hình 3.19 | Kết quả điện di sản phẩm PCR cây chuyển gen biến nạp cấu trúc pBIG/Ubi:OsDREB2A với 02 cặp mồi đặc hiệu gen chuyển và Hygromycin
Ghi chú: A- Điện di sản phẩm PCR kiểm tra DNA tổng số cây Chành trụi chuyển gen với
cặp mồi OsDREB2A-Fw2 và NosT-Rv cho sản phẩm khuếch đại một phần đầu 3’ trình tự mã hóa OsDREB2A và một phần trình tự kết thúc Nos-terminator có kích thước xấp xỉ 325 bp; B- Điện di sản phẩm PCR kiểm tra DNA tổng số cây Chành trụi chuyển gen với cặp
mồi Hyg-Fw/Rv cho sản phẩm khuếch đại có kích thước xấp xỉ 535 bp là một phần trình tự mã hóa gen kháng Hygromycin hptII. Giếng 1-12: khuôn là DNA tổng số của các cây Chành trụi biến nạp cấu trúc pBIG/Ubi:OsDREB2A có thứ tự khơng đổi giữa hai bản gel; MK: thang DNA chuẩn 1 kb.
PCR định lƣợng (qRT-PCR) là một phƣơng pháp có độ nhạy cao, có thể phát hiện lƣợng rất nhỏ khn DNA có mặt trong phản ứng; và có tính chính xác cao, mức độ lặp lại lớn giữa các lần thí nghiệm và giữa các mẫu nhắc lại kỹ thuật. Đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng qRT-PCR sử dụng mồi đánh dấu TaqMan để ƣớc lƣợng số lƣợng bản sao trong cây chuyển gen khác nhau nhƣ: Yang và cộng sự năm 2004 thành công trên lúa; Ingham và cộng sự năm 2001 cũng nhƣ Shou và cộng sự năm 2004 đã thành công trên ngơ. Tuy nhiên, việc sử
nghiệm do đó một số tác giả khác nhƣ Ahmad năm 2005 đã thành công trong việc ứng dụng qRT-PCR sử dụng chất nhuộm SYBR green trong việc ƣớc lƣợng bản sao trên cây lúa chuyển gen.