.7 Kết quả kiểm tra các cây chuyển gen T0

Cấu trúc gen chuyển Tái sinh PCR dƣơng tính

(htpII-gen chuyển) Số bản copy qRT-PCR 1 bản copy > 1 bản copy Lip9: OsDREB2A 15 12 5 7 Ubi: OsDREB2A 12 10 6 4 Lip9: OsDREB1A 23 14 13 6 Ubi: OsDREB1A 20 15 11 4 pBIG-Lip9 16 10 5 5 pBIG-Ubi 13 9 4 5 Tổng 99 70 44 31

Kết quả phân tích qRT-PCR sử dụng chất nhuộm SYBR green trên các cây chuyển gen T0 (Bảng 3.7 và các phụ lục 03-09) cho thấy có 44/75 cây có một bản copy (2ΔCt từ 0,4 - 0,67) và 31/75 cây có số lƣợng bản copy lớn hơn 1 (2ΔCt từ 0,92 - 1,12). Nhƣ vậy 44 cây tái sinh có một bản copy đã đƣợc đƣa ra bầu đất để tiếp tục chăm sóc, phân tích trong nhà lƣới.

Bảng 3.8 | Kết quả theo dõi của các dòng lúa chuyển gen T0 Cấu trúc gen

chuyển Bầu đất nhà lƣới Trổ bông Kết hạt Thu hạt T1

Lip9: OsDREB2A 5 4 2 1 1 Ubi: OsDREB2A 6 3 1 1 0 Lip9: OsDREB1A 13 11 9 8 5 Ubi: OsDREB1A 11 9 7 6 4 pBIG-Lip9 5 3 2 0 0 pBIG-Ubi 4 2 1 0 0 Tổng 44 32 22 16 10

Kết quả sinh trƣởng của các dòng lúa chuyển trong nhà lƣới (Bảng 3.8) cho thấy chỉ có 32/44 dòng lúa chuyển gen có khả năng sinh trƣởng và phát triển bình thƣờng trong điều kiện nhà lƣới; các dòng còn lại chết trong các giai đoạn khác nhau. Tuy nhiên, dù sinh trƣởng bình thƣờng và khơng có sự khác biệt so với cây đối chứng khơng chuyển gen, có nhiều dòng lúa chuyển

gen khơng thể trở bơng và kết hạt bình thƣờng, chỉ có 10 dòng lúa chuyển gen có khả năng kết hạt bình thƣờng trong đó có 5 dòng lúa mang cấu trúc pBIG- Lip9:OsDREB1A; 4 dòng pBIG-Ubi:OsDREB1A và 1 dòng pBIG- Lip9:OsDREB2A. Do số lƣợng hạt thu đƣợc ở dòng lúa chuyển gen pBIG- Lip9:OsDREB2A quá ít (Bảng 3.8) nên chỉ 9 dòng lúa chuyển trình tự mã hóa

OsDREB1A (1 bản copy) đƣợc tiếp tục phân tích trong các thí nghiệm tiếp

theo.

Cả 09 dòng pBIG-Lip9:OsDREB1A đã đƣợc kiểm tra đại diện lại một lần nữa số lƣợng bản sao cấu trúc chuyển gen bằng phản ứng lai DNA- Southern blotting là phƣơng pháp chuẩn cho thí nghiệm xác định số lƣợng bản copy cây chuyển gen trong các phòng thí nghiệm trên thế giới. Tuy nhiên với các phòng thí nghiệm ở Việt Nam để thực hiện phản ứng này hiện chúng ta đang bị hạn chế do chỉ có thể sử dụng việc đánh dấu huỳnh quang cho các đầu dò nên chi phí cao và độ nhạy khơng bằng phƣơng pháp đánh dấu đầu dò với phóng xạ thơng thƣờng. Trong nghiên cứu này, bộ kit đánh dấu huỳnh quang DIG của Roche đã đƣợc sử dụng để thực hiện thí nghiệm xác định số lƣợng bản sao gen chuyển bằng phƣơng pháp lai DNA nhƣ đã miêu tả trong mục 2.2.9.2.

Kết quả phân tích Southern cho thấy 05 cây Lip9:OsDREB1A và 04 cây Ubi:OsDREB1A thế hệ T0 đã đƣợc xác định chỉ mang một bản sao cấu trúc trƣớc đó bằng kỹ thuật qRT-PCR (chỉ số 2ΔCt khi so sánh tƣơng quan giữa lƣợng sản phẩm khuếch đại htpII và 1 gen tham khảo nội sinh ở lúa nhƣ miêu tả trong mục 2.2.9.1 đều có nhỏ hơn 0,55) chỉ cho 1 băng duy nhất khi lai với đầu dò là sản phẩm PCR khuếch đại từ trình tự htpII có đánh dấu huỳnh

quang DIG của hãng Roche (giếng 1-5 và giếng 8-11, Hình 3.20). Ngƣợc lại, cây chuyển gen Ubi:OsDREB1A đƣợc ƣớc lƣợng có 3 hoặc 4 bản copy trƣớc đó bằng phƣơng pháp qRT-PCR (chỉ số 2ΔCt = 1.17±0.126) cho 2 băng trong

đó một băng rất đậm khó xác định gồm 2 hoặc 3 băng (giếng số 7, Hình 3.20). Kết quả đánh giá bằng kỹ thuật lai DNA-DNA Southern blotting đã khẳng định đƣợc khả năng ƣớc tính số lƣợng bản copy của phƣơng pháp qRT-PCR đã sử dụng trong nghiên cứu này. Kết quả nghiên cứu này cũng thêm một lần nữa khẳng định tiềm năng ứng dụng phản ứng qRT-PCR trong việc ƣớc tính số lƣợng bản sao cây chuyển gen đã đƣợc đề cập trong nghiên cứu trƣớc đó của Zhang và cộng sự năm 2015. Trong nghiên cứu của Zhang đã tiến hành so sánh khả năng ƣớc tính số lƣợng bản sao của ngô chuyển gen thế hệ T0 giữa đánh dấu huỳnh quang bằng TaqMan và SYBR green cũng nhƣ phƣơng pháp lai DNA-DNA Southern Blotting

Hình 3.20 | Kết quả kiểm tra số bản sao cây chuyển gen bằng lai Southern Blotting

Ghi chú: M: thang chuẩn DNA (roche); Giếng1-5 cây chuyển gen Lip 9:OsDREB1A ước

tính có 1 bản sao bằng qRT-PCR; giếng 6: cây chuyển gen vector trống ; Giếng 8-11: cây chuyển gen Ubi:OsDREB1A ước tính có 1 bản sao bằng qRT-PCR; Giếng 12: đối chứng âm là cây không chuyển gen; Giếng 7: cây chuyển gen Ubi :OsDREB1A có 3-4 bản copy ước tính bằng qRT-PCR.

3.3.2.2. Sàng lọc các dòng T1 chuyển gen có đặc tính di truyền ổn định

Các hạt thu đƣợc từ cây T 0 hay còn gọi là hạt T1 sẽ đƣợc đá nh giá khả năng nảy mầm trên môi trƣờng bổ sung Hygromycin loại bỏ các cây T1 không

mang cấu trúc chuyển gen do phân ly độc lập và tổ hợp tƣ̣ do của các nhiễm sắc thể. Kết quả cho thấy tỷ lệ hạt nảy mầm dao động từ 60-70% trên tổng số hạt đƣợc đặt trên môi trƣờng Hygromycin (Bảng 3.9 và Hình 3.21).

Hình 3.21 | Kết quả sàng lọc cây chuyển gen đồng hợp qua thông qua tỷ lệ nảy mầm trên môi trƣờng Hygromycin

Ghi chú: Các hạt của cây chuyển gen T0 được bóc vỏ và khử trùng nhẹ với dung dịch Javel 10% trong 10 phút trước khi đặt trên mơi trường MS có bổ sung Hygromycin nồng độ 75 mg/l (đã được tối ưu trước đó với hạt Chành Trụi khơng chuyển gen, đây là nồng độ 100% các hạt không chuyển gen đều chết sau 5 ngày đặt trên môi trường). Tỷ lệ hạt nảy mầm/tổng số hạt được ghi nhận sau 6 ngày kể từ khi đặt hạt. Trong thời gian đầu các hạt đều nảy mầm và phát triển, tuy nhiên sau khi rễ bắt đầu xuất hiện thì một số hạt bị chết trong khi một số hạt khác tiếp tục phát triển. Tỷ lệ hạt nảy mầm nhỏ hơn ¾ số hạt tương ứng với cây cho hạt là cây có một bản sao cấu trúc chuyển gen (mục 2.2.9.3). Các hạt chết được đánh dấu trong vòng tròn; A: Dòng L3 (Lip9:OsDREB1A) tỷ lệ sống 19/30 (63,3%); B: Dòng L5 (Lip9:OsDREB1A) tỷ lệ sống 21/30 (70,0%); C: Dòng U1 (Ubi:OsDREB1A) tỷ lệ sống 18/30 (60,0%); D: Dòng U4 (Ubi:OsDREB1A) tỷ lệ sống 18/30 (60,0%). Thí nghiệm lặp lại 01 lần do hạn chế về số lượng hạt thu được từ cây chuyển gen thế hệ T0.

Các hạt T1 khơng có khả năng nảy mầm trên mơi trƣờng chƣ́a

Hygromycin có thể do hai ngun nhân chính: (i) sự phân ly đợc lập và tổ hợp tƣ̣ do th eo định luật Menden (cây lúa chuyển gen T0 đƣợc cho tự thụ phấn hồn tồn), (ii) vị trí và số lƣợng bản sao của cấu trúc biểu hiện gen trong hệ gen cây chủ ảnh hƣởng tới khả năng biểu hiện của gen chuyển. Các cây lúa non kháng Hygromycin sau đó đƣợc chuyển sang trồng trong điều kiện mơi trƣờng bình thƣờng để tiếp tục phân tích đặc điểm kiểu gen và kiểu hình.

Sự có mặt của cấu trúc chuyển gen trong các cây lúa chuyển gen T1 đƣợc kiểm định bằng hai phản ứng PCR: (i) cặp mồi đặc hiệu của từng cấu

trúc Ubi:OsDREB1A (Ubi-Fw và OsDREB1A-Rv, Bảng 2.2),

Lip9:OsDREB1A (Lip9-Fw và OsDREB1A-Rv, Bảng 2.2); (ii) cặp mồi đặc

hiệu cho gen htpII (Hyg-Fw và Hyg-Rv, Bảng 2.2). Kết quả cho thấy 100% các hạt nảy mầm trên mơi trƣờng có Hygromycin đều cho kết quả dƣơng tính với cả hai phản ứng PCR (Bảng 3.9). Kết quả này chứng tỏ cấu trúc

Lip9:OsDREB2A hoặc cấu trúc Ubi:OsDREB2A đã đƣợc tiếp tục duy trì trong

hệ gen của các cây lúa Chành Trụi thế hệ T1. Để sàng lọc các cây đồng hợp tử ngay từ thế hệ cây T1, phản ứng qRT-PCR lại một lần nữa đƣợc thực hiện với khuôn là DNA của 54 cây lúa chuyển gen (Lip9:OSDREB1A và

Ubi:OsDREB1A) nhƣ đã miêu tả trong mục 2.2.9.1. Do đây đều là các cây

chuyển gen có 1 bản sao (sàng lọc tại mục 3.3.2.1) nên theo tính toán lý thuyết nếu chỉ số 2ΔCt xấp xỉ 1 thì đó là cây chuyển gen T1 đồng hợp tử (cây đã tổ hợp đủ hai nhiễm sắc thể tƣơng đồng đã đƣợc chèn cấu trúc chuyển gen quan tâm).

Kết quả xác định các cây đồng hợp tử về kiểu gen ở Bảng 3.9 cho thấy trong 54 cây mang gen thì có 37 cây có tỷ sớ NC=2ΔCt dao động tƣ̀ 0,38 đến 0,67 tƣơng ƣ́ng với việc các cây này chỉ có 1 alen gen chuyển trong tế bào hay có kiểu gen dị hợp tƣ̣ (tạm gọi Aa). Bên cạnh đó là 17 cây T1 có tỷ số NC

dao động trong khoảng 0,9 đến 1,02 tƣơng ƣ́ng với việc tồn tại đồng thời 2 alen gen chuyển trong các cây chuyển gen tạm gọi đồng hợp tƣ̉ này (kiểu gen AA). Kết quả đánh giá kiểu gen đồng hợp sẽ đƣợc chúng tôi đánh giá tiếp tục ở thế hệ tiếp theo bằng cả hai chỉ tiêu : (i) tỷ lệ nảy mầm trên Hygromycin và (ii) PCR đặc hiệu kết hợp qRT-PCR.

Bảng 3.9 | Kết quả ƣớc tính số lƣợng bản sao và tình trạng đờng hợp các dịng T1

Số cây kiểm tra Số hạt nảy mầm trên Hygromycin PCR dƣơng tính Kiểu gen Dị hợp (Aa) Đồng hợp (AA) Lip9: OsDREB1A L1 12 8 8 6 2 L2 8 5 5 3 2 L3 10 6 6 4 2 L4 6 4 4 3 1 L5 13 8 8 6 2 Ubi: OsDREB1A U1 12 7 7 4 3 U2 7 4 4 3 1 U3 9 6 6 4 2 U4 10 6 6 4 2 Tổng 87 54 54 37 17

Các cây tạm coi là đồng hợp tử (17 cây T1) tiếp tục đƣợc trồng trong điều kiện nhà lƣới để thu hạt. Khi sinh trƣởng phát triển trong nhà lƣới thì chỉ có 12 cây sinh trƣởng bình thƣờng so với cây đối chứng còn 5 cây chết trong các giai đoạn khác nhau. Sau giai đoạn trổ bơng và kết hạt thì có 1 cây ở dòng L1 không trổ bông, 11 cây trổ bơng nhƣng chỉ có 9 cây của 6 dòng lúa chuyển gen kết hạt và thu đƣợc hạt sẽ tiếp tục đƣợc gieo trồng để kiểm tra khả năng sinh trƣởng và chịu hạn (Bảng 3.10).

Các hạt T2 đƣợc chúng tôi thu nhận và tiến hành kiểm tra sƣ̣ nảy mầm ngẫu nhiên của 30 hạt cho mỗi dòng trên môi trƣờng Hygromycin . Kết quả cho thấy tỷ lệ nảy mầm cho mỗi dòng chuyển gen đều đạt trên 96% tổng số hạt thử nghiệm và các cây đều cho phản ƣ́ng PCR dƣơng tính với mồi đặc hiệu của gen chuyển (OsDREB1A). Kết quả này chứng tỏ kỹ thuật qRT-PCR

có thể đƣợc sử dụng để xác định các dòng cây đồng hợp ở thế hệ T1 khi các dòng chuyển gen đã đƣợc xác định chỉ mang 1 bản copy trƣớc đó. Kết quả này có ý nghĩa lớn giúp giảm thời gian sàng lọc các dòng đồng hợp trong các nghiên cứu chuyển gen lúa ở nƣớc ta và tiết kiệm hạt cây chuyển gen hơn so với phƣơng pháp nảy mầm trên môi trƣờng Hygromycin (cần luật số lớn để tính tỉ lệ nảy mầm).

Bảng 3.10 | Kết quả sinh trƣởng của các dòng lúa chuyển gen T1 đồng hợp tử

Cấu trúc gen Số cây

Sinh trƣởng bình thƣờng Số cây trổ bông Số cây kết hạt Số cây cho thu hạt T2 Lip9: OsDREB1A L1 2 2 1 1 1 L2 2 2 2 1 1 L3 2 2 2 2 2 L4* 1 0 L5 2 1 1 1 1 Ubi: OsDREB1A U1 3 2 2 2 2 U2* 1 0 U3* 2 1 1 0 U4 2 2 2 2 2 Tổng 17 12 11 9 9

Ghi chú:*Các dịng sinh trưởng kém hoặc khơng cho hạt sẽ ngừng thí nghiệm

3.4. ĐÁNH GIÁ KIỂU HÌNH CÂY CHUYỂN GEN

3.4.1. Đánh giá sinh trƣởng và phát triển của các dòng lúa chuyển gen T2

Các dòng cây chuyển gen T2 (ít nhất 10 cây mỗi dòng/một thí nghiệm) và các cây đối chứng không chuyển gen khi sinh trƣởng đến giai đoạn 4 lá khoảng 17 ngày tuổi trong bầu đất nhỏ có chiều cao và kích thƣớc tƣơng tự nhau đƣợc chuyển sang các xô đất lớn và nuôi trồng trong điều kiện nhà lƣới để đánh giá sinh trƣởng và phát triển của các dòng lúa chuyển gen so với cây đối chứng không chuyển gen trong điều kiện sinh trƣởng bình thƣờng.

Bảng 3.11 | Một số chỉ tiêu sinh trƣởng của cây chuyển gen T2 và cây đối chứng Cây

Chỉ tiêu sinh trƣởng Số nhánh/

khóm

Chiều cao cây (cm)

Số lƣợng hạt chắc trên bông

Thời gian sinh trƣởng (ngày) Cây đối chứng 5,02 ± 1,21 120,65 ± 3,51 110 ± 3,5 110 ± 3 L1 4,51 ± 1,09 109,12 ± 1,56 100 ± 1,2 105 ± 5 L2 4,49 ± 0,82 125,68 ± 2,02 100 ± 3,5 116 ± 4 L3 5,12 ± 0,89 115,79 ± 2,50 115 ± 2,5 107 ± 5 L5 5,09± 0,95 118,54 ± 1,59 116 ± 1,8 106 ± 4 U1 4,99 ± 0,32 115,12 ± 2,01 107± 3,5 106 ± 5 U4 5,16 ± 0,98 122,46 ±1,58 109± 2,5 108 ± 3

Về kiểu hình, ở hầu hết các cơng thức thí nghiệm, cây chuyển gen đều có lá màu xanh đậm hơn, số nhánh/ khóm thập hơn, cây thấp hơn và sinh trƣởng chậm hơn so với cây đối chứng. Một số cây chuyển gen T2 có hiện tƣợng bạch tạng và ngừng sinh trƣởng trƣớc giai đoạn 4 lá đã bị loại bỏ khỏi số liệu thống kê. Cụ thể là 04 cây từ dòng U1, 05 cây từ dòng U4 và 02 cây từ dòng L3. Tuy nhiên, kết quả cuối cùng sau 03 lần thí nghiệm thì khơng có sự khác biệt lớn có ý nghĩa thống kê giữa các dòng cây chuyển gen và các dòng cây đối chứng (Hình 3.22). Thậm chí một số dòng cây chuyển gen có các chỉ số sinh trƣởng nhƣ: chiều cao cây, số lƣợng hạt trên bông cao hơn so với cây đối chứng (Bảng 3.11).

Hiện tƣợng cây chuyển gen điều khiển chịu hạn có màu lá xanh đậm, số nhánh/khóm cao và sinh trƣởng chậm hơn đối chứng đã đƣợc rất nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới cơng bố. Lý giải hiện tƣợng này là do biểu hiện của các gen điều khiển trong các cây chuyển gen làm thay đổi sinh lý, sinh hoá và đặc biệt là thay đổi hàm lƣợng ABA và biểu hiện dƣ thừa các gen điều kiển trong điều kiện sinh trƣởng bình thƣờng. Mỗi sự kiện chuyển gen, số bản gen gắn và vị trí gắn vào hệ gen hồn tồn độc lập, ngẫu nhiên và đây cũng là nguyên nhân làm cho các cây chuyển gen có những thay đổi kiểu hình. Sau thí nghiệm này, chỉ các dòng L3, L5, U1 và U4 có chỉ số sinh trƣởng phát triển gần tƣơng đƣơng với cây đối chứng đƣợc tiếp tục thử nghiệm, đánh giá khả năng chịu hạn trong các thí nghiệm tiếp theo.

3.4.2. Đánh giá khả năng giữ nƣớc và phục hồi của các dòng lúa chuyển

gen T2

Khi sinh trƣởng đến giai đoạn 4 lá tƣơng ứng với cây 20 ngày tuổi, các cây chuyển gen T2 của các dòng L3. L5, U1 và U4 đƣợc tiến hành đánh giá khả năng giữ nƣớc và khả năng phục hồi theo phƣơng pháp đã mô tả trong mục 2.2.10. Kết quả cho thấy về khả năng giữ nƣớc khơng có sự khác biệt đáng kể giữa cây chuyển gen và cây đối chứng, và cũng khơng có sự khác biệt lớn giữa các cây đƣợc chuyển promoter khác nhau. Nhìn chung, cây sẽ mất 10%, 15%, 30% và tối đa 45% khối lƣợng tƣơng ứng với các khoảng thời gian 1 giờ, 4 giờ, 7 giờ và 10 giờ trong bốc cấy (Bảng 3.12, Hình 3.23).

Bảng 3.12 | Khả năng giữ nƣớc của các dòng lúa chuyển gen T2

Tên dòng Độ hụt khối lƣợng tƣơng đối (%)

01 giờ 04 giờ 07 giờ 10 giờ

WT (đối chứng) 10,00 ± 0,25 14,55 ± 0,45 30,55 ± 0,36 44,7 ± 0,24 L3 9,67 ± 0,36 14,01 ± 0,56 27,08 ± 0,52 43,2 ± 0,46 L5 8,67 ± 0,32 13,98 ± 0, 49 26,57 ± 0,78 43,60 ± 0,59 U1 9,67 ± 0,23 14,01 ± 0, 32 28,45 ± 0,62 44,5 ± 0,43 U4 8,99 ± 0,36 13,95 ± 0,28 27,45 ± 0,54 43,30 ± 0,21

Khả năng giữ nƣớc là một trong những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá tính chịu hạn ở thực vật và khả năng này phụ thuộc vào các đặc tính nhƣ: sự cuộn lá, đóng mở khí khổng, tham gia cơ chế giảm áp suất trƣơng của lá, giảm lƣợng nƣớc bị mất của cây và hoạt hoá sự biểu hiện hàng loạt các gen liên quan đến tính chịu hạn. Trong nghiên cứu này, các gen điều khiển chịu hạn đã đƣợc xác định sự tồn tại và có thể đã biểu hiện tốt trong các cây chuyển gen. Tuy nhiên, nghiên cứu khả năng giữ nƣớc cho kết quả có sự khác biệt rất ít giữa cây chuyển gen và cây khơng chuyển gen (cây đối chứng).

Hình 3.24 | Khả năng giữ nƣớc và phục hồi của các dòng chuyển gen T2 sau mất nƣớc cƣỡng bức

Ghi chú: A- Các cây chuyển gen và đối chứng ở giai đoạn 4 lá; B-E: Mức độ phản ứng