Thành phần MS MS-AS AAM MS-S MS-R KNO3 NH4NO3 KH2PO4 MgSO4.7H2O CaCl2 NaH2PO4.2H2O KCl Na2EDTA FeSO4.7H20 Fe-EDTA MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O KI H3BO3 Na2MoO4.2H2O Cazein Hydrolysate Glycine L-Argnine L-Proline L-Glutamine L-Aspartic acid Myo-Inositol Nicotin acid Pyridoxine HCl Thiamine HCl 2,4-D Kinetin NAA Acetosyringone Sucrose Maltose Nƣớc dừa Hygromycin Gerlite pH 1.900 1.650 170 370 440 37,25 27,85 22,3 8,6 0,025 0,025 0,83 6,2 0,25 2,0 500 100 0,5 0,5 1,0 2,0 0,25 30.000 4.000 5,8 1.900 1.650 170 370 440 37,25 27,85 22,3 8,6 0.025 0,025 0,83 6,2 0,25 300 2,0 100 0,5 0,5 1,0 2,0 0,25 15,0 30.000 10.000 4.000 5,2 250 150 150 3.000 40 10 2,0 0,025 0,025 0,75 3,0 0,25 500 7,5 176,7 900 300 100 1,0 1,0 10 15.0 68.000 36.000 5,2 1.900 1.650 170 370 440 37,25 27,85 22,3 8,6 0,025 0,025 0,83 6,2 0,25 300 2,0 300 100 0,5 0,5 1,0 2,5 0,25 30.000 50 4.000 5,8 1.900 1.650 170 370 440 37,25 27,85 22,3 8,6 0,025 0,025 0,83 6,2 0,25 300 2,0 300 100 0,5 0,5 1,0 2,0 0,1 30.000 1.500 50 4.000 5,8
Các hóa chất: Các loại enzyme cắt giới hạn, enzyme T4 ligase, Dream
Taq polymerase, Pfu polymerase, thang chuẩn DNA 1 kb và bộ kit tinh sạch DNA plasmid GeneJET Plasmid Miniprep Kit đƣợc đặt mua của hãng Fermentas (ThermoFisher). Real-time PCR MESA Blue của hãng Eurogentec.
Các hóa chất sử dụng để tinh sạch RNA tổng số (Trizol), sinh tổng hợp cDNA (SuperScript® III First-Strand Synthesis System, GeneRaceTM
Kit) và các loại kháng sinh đƣợc đặt mua từ hãng Invitrogen (ThermoFisher). Bộ hóa chất dùng cho thí nghiệm lai DNA-DNA Southern (DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II) đƣợc mua của Roche (Sigma-Aldrich). Các hóa chất cơ bản sử dụng cho sinh học phân tử đƣợc mua của công ty Sigma và Merk (Mỹ) đều đạt độ tinh khiết cần thiết dùng cho sinh học phân tử. Các hóa chất cơ bản, các chất kích thích sinh trƣởng, kháng sinh sử dụng trong nuôi cấy mô đƣợc mua các công ty Sigma và Merk (Mỹ).
2.1.3. Thiết bị
Máy PCR 9700 của hãng Perkin Elmer; hệ thống điện di DNA và protein của hãng Biorad; máy ly tâm Universal 30RF của hãng Hettich, Biofuge 28RS của hãng Heraus; máy chụp ảnh huỳnh quang Firereader của hãng UVItec; hệ thống máy Real Time PCR System 7500 của Công ty AB Applied Biosystem.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xƣ̉ lý cây lúa trong điều kiện hạn
Thí nghiệm xử lý stress giả định đối với cây lúa non đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp của Qin và nhóm nghiên cứu [82]. Hạt lúa đƣợc ngâm trong nƣớc ấm sạch qua 48-50 h, rồi đƣợc ủ trong nƣớc ở 37oC trong 2 ngày trong tủ ấm; hạt nảy mầm đƣợc chuyển sang trồng trong dung dịch MS ở điều kiện 28oC trong 2 tuần. Trong thí nghiệm xử lý hạn, rễ mạ 2 tuần tuổi (3-4 lá) đƣợc nhúng vào dung dịch MS có chứa PEG 20% để tạo điều kiện stress khô hạn và mất nƣớc giả định, cây lúa non đƣợc nhấc ra khỏi dung dịch xử lý, đặt
lƣợng gió: 364 m3/h) trong 30 phút. Sau mỗi khoảng thời gian xử lý từ 1 h; 6 h; 12 h và 24 h, mẫu lúa đƣợc cố định bằng nitơ lỏng và bảo quản tới khi tách chiết RNA.
2.2.2. Tách chiết, định lƣợng DNA/RNA
2.2.2.1. Tách chiết DNA tổng số ở lúa
DNA tổng số đƣợc tách bằng hóa chất CTAB [88], các mẫu DNA tổng số sau đó sẽ đƣợc kiểm tra chất lƣợng bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1% (mục 2.2.2.4) và đo quang phổ hấp thụ (OD) để kiểm tra hàm lƣợng và chất lƣợng DNA tổng số thu đƣợc.
2.2.2.2. Tách chiết RNA tổng số từ lúa
RNA tổng số đƣợc tách chiết từ lá lúa non theo quy trình hƣớng dẫn của hãng Invitrogen. Mẫu thực vật tƣơi đƣợc thu và bảo quản trong N2 lỏng cho tới khi tách chiết. 100 mg mẫu mô thực vật đƣợc nghiền thành bột mịn trong N2 lỏng và chuyển vào ống eppendorf 1,5 ml. Sau đó, 1 ml Trizol đƣợc bổ sung vào ống; ống đƣợc đảo đều và ủ trên đá trong 5 phút. Tiếp theo, 200 μl chloroform đƣợc bổ sung vào hỗn hợp; ống đƣợc lắc mạnh bằng máy vontex trong 15 giây, sau đó đƣợc ủ trên đá trong 15 phút. Ống đƣợc ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong 5 phút, ở 4oC. Dịch nổi đƣợc chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới. 500 μl isopropanol đƣợc bổ sung vào dung dịch; ống đƣợc ủ trên đá trong 15 phút để kết tủa RNA. Kết tủa đƣợc thu lại bằng cách ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút, trong 15 phút, ở 4oC và đƣợc rửa lại trong 1 ml ethanol 70%. Ống đƣợc lắc mạnh trong 15 giây, sau đó đƣợc ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 10 phút, ở 4oC. Dịch nổi bị loại bỏ và kết tủa đƣợc làm khô trong 1 giờ. Kết tủa RNA cuối cùng đƣợc hòa tan lại
2.2.2.3. Tách chiết DNA plasmid
DNA tái tổ hợp đƣợc tinh sạch từ tế bào vi khuẩn E. coli bằng bộ kit GenJETTM Plasmid Miniprep (Fermentas). Một khuẩn lạc dƣơng tính đƣợc ni lắc trong 5 ml mơi trƣờng LB lỏng có bổ sung chất kháng sinh với tốc độ 220 vòng/phút ở 37°C qua đêm. Tế bào đƣợc thu bằng cách ly tâm ở vận tốc 6.000 vòng/phút trong 10 phút, ở 4oC, sau đó đƣợc hòa trở lại trong 250 μl đệm P1 (Resuspension solution) đã bổ sung enzyme RNAse A. 250 μl đệm P2 (Lysis solution) đƣợc bổ sung vào dịch tế bào. Hỗn hợp đƣợc ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút để phá vỡ tế bào giải phóng plasmid. Hỗn hợp sau đó đƣợc trung hòa bởi 350 μl đệm P3 (Neutralization solution). Mảnh vỡ tế bào và protein biến tính đƣợc loại bỏ bằng cách ly tâm hỗn hợp với vận tốc 13.000 vòng/phút trong 10 phút, ở 4°C. Dịch nổi sau khi ly tâm đƣợc đƣa lên cột tinh sạch plasmid và ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút. Plasmid đƣợc giữ lại trên lớp màng silica còn dịch qua cột đƣợc gạn bỏ. 500 μl đệm rửa (Wash buffer) đƣợc bổ sung và ly tâm 30-60 giây, sau đó gạn bỏ dịch qua cột. Bƣớc này đƣợc lặp lại một lần nữa. Cột tinh sạch chứa plasmid đƣợc chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới. 50 μl đệm đẩy (Elution buffer) đƣợc bổ sung vào chính giữa màng silica của cột và đƣợc ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút. Plasmid đƣợc thu bằng cách ly tâm ống với vận tốc 10.000 vòng/phút trong 1 phút. Mẫu DNA plasmid tinh sạch cuối cùng đƣợc bảo quản ở -20°C.
2.2.2.4. Điện di DNA/RNA trên gel agarose
DNA/RNA trong mẫu thí nghiệm đƣợc phát hiện và định lƣợng tƣơng đối bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose và nhuộm Ethidium bromide (EtBr) theo phƣơng pháp của Sambrook và Russel [88].
Điện di DNA: 1,0 g agarose đƣợc đun nóng trong 100 ml đệm TAE và
đúc vào khn. Sau khi gel đơng hồn toàn, hỗn hợp mẫu gồm 5 l mẫu DNA đƣợc trộn với 1 l đệm mẫu có chứa chất chỉ thị màu là bromophenol xanh, xylene cyanol và EtBr ở nồng độ 50 g/l đƣợc tra vào các giếng trên bản gel. Mẫu đƣợc điện di với hiệu điện thế ổn định là 10 V/cm gel đến khi vạch màu bromophenol xanh cách mép gel 2 cm thì dừng lại. Sau đó, gel đƣợc lấy ra và soi dƣới ánh sáng tử ngoại của máy soi gel, các băng gắn với EtBr xuất hiện dƣới dạng các băng màu sáng trên nền gel màu đen.
Điện di RNA: 1,8 g agarose đƣợc đun nóng để hòa tan trong 170 ml
H2O, sau đó làm mát về 65o
C. 10 ml formaldehyde (37%) và 20 ml đệm MOPS 10 X đƣợc bổ sung vào dung dịch, lắc đều và đổ vào khuôn đúc gel. Sau khi gel đƣợc chuẩn bị, 10 μl RNA đƣợc trộn với 20 μl đệm mẫu RNA (có chứa formamide, formaldehyde, EtBr) và ủ ở 65oC trong 5 phút, sau đó đƣợc làm mát trên đá. Trƣớc khi tra mẫu điện di, gel đƣợc điện di khởi động ở hiệu điện thế 5 V/cm trong 5 phút. Mẫu đƣợc trộn với 2 μl đệm có chứa chất chỉ thị màu bromophenol xanh, sau đó đƣợc tra vào giếng và điện di với hiệu điện thế 100 V trong 10 phút và 65 V trong 90 phút. Sau đó, gel đƣợc lấy ra và soi dƣới ánh sáng tử ngoại của máy soi gel, các băng gắn với EtBr xuất hiện dƣới dạng các băng màu sáng trên nền gel màu đen.
2.2.3. Sinh tổng hợp DNA bổ sung hoàn chỉnh (full-length cDNA)
cDNA hoàn chỉnh đƣợc chúng tôi sinh tổng hợ p tƣ̀ RNA tổng số thu đƣợc tƣ̀ mục 2.2.2.2 bằng bộ hóa chất GeneRacer TM
Kit của hãng Invitrogen theo đúng quy trình của hãng
(https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/generacer_man.pdf). Quy trình thí nghiệm (Hình 2.1) có thể tóm tắt gồm 4 bƣớc chính nhƣ sau: Đầu tiên tiến hành loại bỏ gốc PO4 ở đầu 5’ của các phân tƣ̉ không phải
RNA thông tin trƣởng thành (không có mũ m7G-p-p-p ở đầu 5’) bằng enzyme calf intestinal phosphatase (CIP). Tiếp đó loại bỏ mũ ở đầu 5’ của RNA thông tin trƣởng thành bằng enzyme có nguồn gốc tƣ̀ cây t huốc lá - tobacco acid pyrophosphatase (TAP). Gắn các RNA thông tin trƣởng thành với một đoạn RNA cung cấp theo bộ hóa chất nhờ enzyme RNA ligase . Trong phản ƣ́ng này do chỉ có RNA thơng tin trƣởng thành còn mang gốc PO 4 nên chỉ có loại RNA này có thể gắn đƣợc với đoạn RNA cung cấp theo bộ hóa ch ất. Bƣớc cuối cùng, thƣ̣c hiện phản ƣ́ng phiên mã ngƣợc (Reverse transcriptase) với cặp mồi gồm mồi xuôi bám đặc hiệu trên vùng RNA của bộ kit và mồi ngƣợc là mồi oligodT bám vào vùng polyA của RNA thông tin . Phản ứng đƣợc thực hiện với enzyme phiên mã ngƣợc SuperScript™ III RT. cDNA hoàn chỉnh thu đƣợc tƣ̀ phản ƣ́ng trên sẽ đƣợc lƣu trƣ̃ ở -20oC và đƣợc sƣ̉ dụng làm khn nhân bản các trình tự mong muốn trong các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 2.1 | Giản đồ miêu tả kỹ thuật sinh tổng hợp sợi phân tử cDNA sợi 1 của mRNA
trƣởng thành (GeneRacerTM
2.2.4. Nhân bản đoạn DNA đặc hiệu bằng kĩ thuật PCR
Các đoạn gen đƣợc nhân bản từ khuôn DNA tổng số hoặc cDNA của lúa bằng kỹ thuật PCR thơng thƣờng [88]. Theo đó, tùy từng loại khn và đặc điểm đoạn cần nhân bản phản ứng đƣợc tiến hành tối ƣu hóa điều kiện phản ứng với máy nhân gen gradient với ít nhất 06 điều kiện nhiệt độ để tìm đƣợc điều kiện tối ƣu. Tiếp đó, lƣợng khn thích hợp sẽ đƣợc tối ƣu hóa để có thể thu đƣợc sản phẩm đặc hiệu (đơn băng, ít nhiễu tạp...) đáp ứng yêu cầu cho các phản ứng nhân dòng, sàng lọc tiếp theo.
2.2.4.1. Tinh sạch DNA từ gel agarose
Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch từ gel agarose bằng bộ kit GenJETTM Gel Extraction (Fermentas) theo quy trình hƣớng dẫn. Băng DNA quan tâm đƣợc cắt chính xác từ gel agarose và đƣa vào ống eppendorf 1,5 ml. Đệm bám (Binding buffer) đƣợc bổ sung vào ống (1 µl đệm ~ 1 mg gel); ống đƣợc ủ ở 60°C trong khoảng 10 phút đến khi gel tan hoàn toàn. Dung dịch gel agarose đã hòa tan đƣợc chuyển lên cột tinh sạch và ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 1 phút. 500 µl đệm rửa (Wash buffer) đƣợc bổ sung vào cột và ly tâm trong 1 phút ở vận tốc 10.000 vòng/phút. Bƣớc rửa cột đƣợc lặp lại một lần nữa. 100 µl đệm đẩy (Elution buffer) đƣợc bổ sung vào chính giữa lớp màng silica của cột. DNA đƣợc thu bằng cách ly tâm cột trong 1 phút ở tốc độ 10.000 vòng/phút. Mẫu DNA tinh sạch đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose (mục 2.2.2.4) và đƣợc bảo quản ở -20°C.
2.2.4.2. Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector nhân dòng
Cả sản phẩm PCR và vector pUC19 đều đƣợc cắt bởi BamHI. Tuy
Đệm của enzym (10X) Sản phẩm PCR/vector pUC19 (1 μg/μl) BamHI (10 unit/μl) dH2O : 2 hoặc 5μl : 10 hoặc 20 μl : 1 hoặc 2 μl : 7 hoặc 23 μl Tổng thể tích : 20 hoặc 50 μl
Phản ứng cắt đƣợc tiến hành ở 37oC trong 1 giờ và đƣợc tinh sạch bằng phƣơng pháp phenol lạnh nhƣ trình bày ở mục 2.2.4.1. Vector pUC19 sau khi cắt bởi BamHI đƣợc tiếp tục xử lý bởi enzym CIAP (alkaline phosphatase) để loại bỏ một nhóm PO4 ở đầu 5’ để tránh hiện tƣợng tự gắn lại của vector khi tiến hành phản ứng gắn với sản phẩm PCR. Cả sản phẩm PCR và vector pUC19 đều đƣợc xử lý bởi BamHI nên đều có đầu dính (GATC) của enzym
BamHI ở hai đầu. Vì vậy sản phẩm PCR sẽ đƣợc gắn vào vector pUC19 khi
có enzym DNA T4 ligase. Thành phần phản ứng gắn cụ thể nhƣ sau:
Đệm của enzym (10X) Sản phẩm PCR (50 ng/μl) Vector pUC19 (200 ng/μl) T4 ligase (10 unit/μl) dH2O : 1 μl : 1 μl : 1 μl : 1 μl : 6 μl Tổng thể tích : 10 μl
Phản ứng gắn đƣợc tiến hành ở 25oC trong thời gian 1 giờ.
2.2.4.3. Chuẩn bị tế bào khả biến E. coli DH5α
Cấy trải 10 µl dịch tế bào DH5 giữ ở -80oC trên môi trƣờng LB đặc và nuôi qua đêm ở 370C. Nuôi cấy lắc 200 vòng/phút qua đêm ở 37o
C một khuẩn lạc đơn trong 5 ml môi trƣờng LB lỏng. Bổ sung 500 ml môi trƣờng LB lỏng vào 5 ml dung dịch nuôi qua đêm và tiếp tục nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37o
C khoảng 2 giờ (OD600=0,4 - 0,6). Ly tâm ở 3.000 vòng/phút trong thời gian 10 phút, thu cặn tế bào và hoà tan trong 20 ml CaCl2 0,1M lạnh. Ủ tế bào trong dung dịch CaCl2 0,1M; giữ hỗn hợp trên đá trong khoảng 2 giờ, tiếp tục ly tâm ở tốc độ 3.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4o
trong 20 ml dung dịch CaCl2 0,1 M và 10% glycerol. Chia tế bào khả biến DH5 vừa chuẩn bị thành từng lƣợng nhỏ 80 - 100 µl vào các ống eppendorf và bảo quản ở -80o
C.
2.2.4.4. Biến nạp gen OsDREB1A/OsDREB2A vào tế bào E. coli bằng
phƣơng pháp sốc nhiệt
Bổ sung 10 μl hỗn hợp phản ứng gắn (mục 2.2.4.2) vào tế bào khả biến DH5α. Trộn nhẹ và ủ trong đá 20 phút tạo điều kiện cho các vector bám lên thành tế bào. Sau đó, phản ứng sốc nhiệt đƣợc thực hiện bằng việc chuyển hỗn hợp phản ứng trên vào bể ổn nhiệt ở 42oC trong 60 giây, ngay lập tức ủ hỗn hợp vào đá trong 5 phút. Hỗn hợp phản ứng sau đó đƣợc trải trên đĩa mơi trƣờng LB đặc có bổ sung 100 μg/ml ampicilin, ni trong tủ ấm 37o
C qua đêm. Các khuẩn lạc đƣợc sàng lọc xanh trắng và bằ ng PCR với cặp mồi T 7 của vector nhân dòng pUC19 [88].
2.2.4.5. Đọc trình tự gen OsDREB1A/OsDREB2A
Nguyên tắc: Đoạn trình tự gen đặc hiệu sau khi đƣợc nhân dòng vào vector pUC19 sẽ đƣợc đọc trên hệ thống máy giải trình tự ABI 3100. Cụ thể, phản ứng PCR đƣợc tiến hành qua 2 bƣớc: bƣớc PCR thông thƣờng để khuếch đại đoạn trình tự cần đọc và bƣớc PCR cho xác định trình tự . Trong đó, phản ứng PCR thơng thƣờng sử dụng khuôn là vector tái tổ hợp pUC 19 mang đoạn gen đặc hiệu với cặp mồi T 7 xuôi và ngƣợc của vector . Sản phẩm PCR sau đó đƣợc tinh sạch, pha lỗng ở nồng độ thích hợp và dùng làm khn cho phản ứng PCR xác định trình tự.
Phản ứng PCR trong phản ứng đọc trình tự có các thành phần giống nhƣ PCR thơng thƣờng nhƣng có một số khác biệt là sự có mặt của ddNTP và chỉ cần dùng một loại mồi (mồi xuôi hoặc mồi ngƣợc). Các ddNTP khác với
các dNTP là thiếu một nhóm 3’-OH nên khi đƣợc enzyme DNA polymerase gắn vào chuỗi DNA đang tổng hợp thì chúng sẽ khơng thể hình thành liên kết phosphodiester với nucleotide đƣợc đƣa vào kế tiếp và khiến cho quá trình kéo dài chuỗi bị ngừng lại.
Nhƣ vậy, từ một đoạn DNA ban đầu, nhiều sợi đơn mới đƣợc đánh dấu ở một đầu tận cùng bằng ddNTP sẽ đƣợc tổng hợp và các sợi này có độ dài khác biệt nhau một nucleotide. Các sợi đơn mới tổng hợp đƣợc phân tách trên gel điện di acrylamide dạng mao quản. Máy đọc trình tự sẽ tự động phân tích các kết quả để đƣa ra trình tự đoạn DNA gốc.
2.2.5. Thiết kế vector chuyển gen
Hệ vector chuyển gen pBI 101 dƣới sƣ̣ điều kiển của promoter Ubiquitin hoặc Lip 9 (tƣ̀ đây đƣợc gọi tắt là pBI -Ubi và pBI -Lip9) đã đƣợc thiết kế bởi phòng thí nghiệm Bệnh học phân tƣ̉ thƣ̣c vật có khả năng tiếp nhận gen chuyển nhờ 3 vị trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn (BamHI, SmaI và SacI) nằm trong vùng trình tự đa điểm cắt (Hình 2.2).