2.1. VẬT LIỆU VÀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Tập đoàn 46 giống lúa đƣợc cung cấp bởi Viện Khoa học kỹ thuật Nơng Lâm nghiệp miền núi phía Bắc , giống lúa Chành trụi và Cƣờm dạng I đƣợc cung cấp bởi Trung tâm Tài nguyên Thực vật. Danh sách giống đƣợc trình bày ở Bảng 2.1. Các giống lúa số thứ tự từ 1 - 47 đƣợc sử dụng cho nghiên cứu phát triển hệ thống tái sinh và tiếp nhận gen lạ. Giống Cƣờm Dạng I và giống lúa Mộc Tuyền (cung cấp bởi Bộ môn Bệnh học Phân tử thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp) đƣợc sử dụng để nhân bản các trình tự mã hóa nhân tố phiên mã OsDREB1A và OsDREB2A.
Bảng 2.1 | Danh sách các giống lúa đƣợc trồng ở miền Bắc Việt Nam đƣợc sử dụng trong nghiên cứu
Số ký hiệu giống Tên giống Số ký hiệu giống Tên giống Số ký hiệu giống Tên giống 1 DR4 17 IR554321 33 YUNLU100B 2 DR5 18 LB1-2 34 YUNLU103-1B 3 IR74371-3-1-1 19 LB-2M 35 YUNLU106 4 IR74371-54-1 20 LHY-4 36 YUNLU103-2B 5 IR78878-5-1-3-3 21 LCV-8M 37 YUNLU103-2 6 IR55419-04-AO 22 GTNM 38 YUNLU105-B 7 YUNLU50 23 IR81430-B-B-94 39 YUNLU104A 8 LUYIN46 24 IR84179-B-403 40 YUNLU105 9 LC93-1* 25 IR81413-B-B-75-2 41 YU07H-34789 10 IR78878-5-1-3-1 26 IR80416-B-152-4 42 IR82870-48 11 IR78878-176-B-2-B 27 IR81040-B-87-U2-1 43 YUNLU104-B 12 IR79889-B-179-2-2 28 LP-5M 44 Nếp Khau Để Dỏn 13 IR79913-B-326B 29 IR79906-B-5-3-3 45 Nếp Khau Pí Pột 14 IR78875-131-B-1-4 30 YUNLU69 46 LC93-4
15 IR79913-B-176-4 31 YUNLU65 47 Chành Trụi 16 CIRAD141 32 YUNLU100A 48 Cƣờm Dạng I
49 Mộc Tuyền
* Nhóm phụ japonica; cịn lại: nhóm indica (nguồn: Viện KHKT Nơng Lâm nghiệp miền núi phía Bắc và Trung tâm Tài nguyên Thức vật, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam.
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu
2.1.2.1. Các chủng vi sinh vật
Chủng vi khuẩn E. coli DH5α, chủng vi khuẩn A. tumefaciens LBA
4404, EHA 105 do Bộ môn Bệnh học phân tử, viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp.
2.1.2.2. Các vector và primer
Bảng 2.2 | Trình tự các primer (oligo-nucleotide) sử dụng trong nghiên cứu
Tên oligo Trình tự Gen/vector
OsDREB1A-Fv 5’-GAGGATCCATGTGCGGGATCA-3’ OsDREB1A
OsDREB1A-Rw 5’-GAGGATCCTAGTAGCTCCAGAG-3 OsDREB1A
OsDREB1A-Fwt 5’-GACGACGACGAGGAGTCCGC-3’ OsDREB1A
pUC19-Rv 5’-TATTTAGGTGACACTATAG-3’ pUC19
pUC19-Fw 5’-CAGCTATGACCATGATTACGC-3’ pUC19
OsDREB2A-Rv 5’-ATGGATCCCTAATAGGAGAAAAG-3’ OsDREB2A
OsDREB2A-Fw 5’-ATGGATCCATGGAGCGGGGGGAG-3’ OsDREB2A
OsDREB2A-Fwt 5’-CGTGTAGTCCCTGAGGTGCAGG-3’ OsDREB2A
OsDREB2A-Fw-P 5’-GAGGCGACGCAGATCTGAAC-3’ OsDREB2A
OsDREB2A-Rv-P 5’-ACCCGCAGCATGACTACTAC-3’ OsDREB2A
Lip9-Fw 5’-GCGAATAGTTCTTGCTGATC-3’ pBIG-Lip9 Ubi-Fw 5’-CCCTGCCTTCATACGCTATT-3’ pBIG-Ubi NosT-Fw 5’-TTGCCGGTCTTGCGATGATT-3’ pBIG-Lip9/Ubi NosT-Rv 5’-ACCGCGCGCGATAATTT-3’ pBIG-Lip9/Ubi NosT-Rvt 5’-AGACCGGCAACAGGATTCAA-3’ pBIG-Lip9/Ubi DIP1-Fw 5’-CCATGGTTGGAATTTGGAAG-3’ DIP-1
DIP1-rv 5’-CCAGCCCAAAACCAATACAA-3’ DIP-1
SALT-Fw 5’-GAGGGTCAGCTCAGGACATCA-3’ SALT
SALT-Rv 5’-AAGCGTTCCAGACCTTCCAAA-3’ SALT
Actin-Fw 5’-TGATGGTGTCAGCCACACT-3’ Actin
Actin-Rv 5’-TGGTCTTGGCAGTCTCCATT-3’ Actin
Hyg-Fw 5’-AAACTGTGATGGACGACACCGT-3’ hptII
Hyg-Rv 5’-GTGGCGATCCTGCAAGCTCC-3’ hptII
Hyg-RT-Fw 5’-CGAAGAATCTCGTGCTTTCA-3’ hptII
Hyg-RT-Rv 5’-ATGCAAAGTGCCGATAAACA-3’ hptII
Các vector pBIG-Lip9, pBIG-Ubi, thƣ viện cDNA xử lý hạn của giống Mộc Tuyền sử dụng trong nghiên cứu do Bộ môn Bệnh học phân tử (Viện Di
phản ứng PCR, đầu dò cho thí nghiệm lai DNA (Sorthern blotting) đƣợc đặt mua từ hãng Invitrogen (Mỹ) và Sigma (Mỹ).
2.1.2.3. Mơi trƣờng và hóa chất
Môi trƣờng: Các môi trƣờng: MS, MS-AS, AAM, MS-S, MS-R đƣợc
sử dụng trong nghiên cứu có thành phần nhƣ trình bày ở Bảng 2.3.
Mơi trường tạo callus: Sử dụng môi trƣờng cơ bản MS (Murashige and
Skoog, 1962) với nồng độ 2,4-D dao động từ 1,5 – 2,5 mg/l, tỉ lệ muối MS dao động từ 0,5 – 1,5. Cụ thể nhƣ sau:
- MS1: MS + 1,5 mg/l 2,4-D + 0,8% aga + 3% saccharose;
- MS2: MS + 2 mg/l 2,4-D + 0,8% aga + 3% saccharose;
- MS3: MS + 2,5 mg/l 2,4-D + 0,8% aga + 3% saccharose.
Môi trường tái sinh cây: Sử dụng môi trƣờng MS bổ sung BAP,
kinetine (0,5; 2mg/l), casein (0,1 mg/l), cụ thể nhƣ sau:
- TS1: MS + 2 mg/l BAP + 0,5 mg/l kinetine + 0,7% aga + 3% saccharose;
- TS2: MS + 2 mg/l BAP + 0,5 mg/l kinetine + 0,7% aga + 3% saccharose + 0,1 mg/l casein;
- TS3: MS + 0,5 mg/l BAP + 2 mg/l kinetine + 0,7% aga + 3% saccharose;
- TS4: MS + 0,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l kinetine + 0,7% aga + 3% saccharose.
Bảng 2.3 | Thành phần môi trƣờng đã đƣợc sử dụng trong chuyển gen lúa (mg/l) Thành phần MS MS-AS AAM MS-S MS-R Thành phần MS MS-AS AAM MS-S MS-R KNO3 NH4NO3 KH2PO4 MgSO4.7H2O CaCl2 NaH2PO4.2H2O KCl Na2EDTA FeSO4.7H20 Fe-EDTA MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O KI H3BO3 Na2MoO4.2H2O Cazein Hydrolysate Glycine L-Argnine L-Proline L-Glutamine L-Aspartic acid Myo-Inositol Nicotin acid Pyridoxine HCl Thiamine HCl 2,4-D Kinetin NAA Acetosyringone Sucrose Maltose Nƣớc dừa Hygromycin Gerlite pH 1.900 1.650 170 370 440 37,25 27,85 22,3 8,6 0,025 0,025 0,83 6,2 0,25 2,0 500 100 0,5 0,5 1,0 2,0 0,25 30.000 4.000 5,8 1.900 1.650 170 370 440 37,25 27,85 22,3 8,6 0.025 0,025 0,83 6,2 0,25 300 2,0 100 0,5 0,5 1,0 2,0 0,25 15,0 30.000 10.000 4.000 5,2 250 150 150 3.000 40 10 2,0 0,025 0,025 0,75 3,0 0,25 500 7,5 176,7 900 300 100 1,0 1,0 10 15.0 68.000 36.000 5,2 1.900 1.650 170 370 440 37,25 27,85 22,3 8,6 0,025 0,025 0,83 6,2 0,25 300 2,0 300 100 0,5 0,5 1,0 2,5 0,25 30.000 50 4.000 5,8 1.900 1.650 170 370 440 37,25 27,85 22,3 8,6 0,025 0,025 0,83 6,2 0,25 300 2,0 300 100 0,5 0,5 1,0 2,0 0,1 30.000 1.500 50 4.000 5,8
Các hóa chất: Các loại enzyme cắt giới hạn, enzyme T4 ligase, Dream
Taq polymerase, Pfu polymerase, thang chuẩn DNA 1 kb và bộ kit tinh sạch DNA plasmid GeneJET Plasmid Miniprep Kit đƣợc đặt mua của hãng Fermentas (ThermoFisher). Real-time PCR MESA Blue của hãng Eurogentec.
Các hóa chất sử dụng để tinh sạch RNA tổng số (Trizol), sinh tổng hợp cDNA (SuperScript® III First-Strand Synthesis System, GeneRaceTM
Kit) và các loại kháng sinh đƣợc đặt mua từ hãng Invitrogen (ThermoFisher). Bộ hóa chất dùng cho thí nghiệm lai DNA-DNA Southern (DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II) đƣợc mua của Roche (Sigma-Aldrich). Các hóa chất cơ bản sử dụng cho sinh học phân tử đƣợc mua của công ty Sigma và Merk (Mỹ) đều đạt độ tinh khiết cần thiết dùng cho sinh học phân tử. Các hóa chất cơ bản, các chất kích thích sinh trƣởng, kháng sinh sử dụng trong nuôi cấy mô đƣợc mua các công ty Sigma và Merk (Mỹ).
2.1.3. Thiết bị
Máy PCR 9700 của hãng Perkin Elmer; hệ thống điện di DNA và protein của hãng Biorad; máy ly tâm Universal 30RF của hãng Hettich, Biofuge 28RS của hãng Heraus; máy chụp ảnh huỳnh quang Firereader của hãng UVItec; hệ thống máy Real Time PCR System 7500 của Công ty AB Applied Biosystem.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xƣ̉ lý cây lúa trong điều kiện hạn
Thí nghiệm xử lý stress giả định đối với cây lúa non đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp của Qin và nhóm nghiên cứu [82]. Hạt lúa đƣợc ngâm trong nƣớc ấm sạch qua 48-50 h, rồi đƣợc ủ trong nƣớc ở 37oC trong 2 ngày trong tủ ấm; hạt nảy mầm đƣợc chuyển sang trồng trong dung dịch MS ở điều kiện 28oC trong 2 tuần. Trong thí nghiệm xử lý hạn, rễ mạ 2 tuần tuổi (3-4 lá) đƣợc nhúng vào dung dịch MS có chứa PEG 20% để tạo điều kiện stress khô hạn và mất nƣớc giả định, cây lúa non đƣợc nhấc ra khỏi dung dịch xử lý, đặt
lƣợng gió: 364 m3/h) trong 30 phút. Sau mỗi khoảng thời gian xử lý từ 1 h; 6 h; 12 h và 24 h, mẫu lúa đƣợc cố định bằng nitơ lỏng và bảo quản tới khi tách chiết RNA.
2.2.2. Tách chiết, định lƣợng DNA/RNA
2.2.2.1. Tách chiết DNA tổng số ở lúa
DNA tổng số đƣợc tách bằng hóa chất CTAB [88], các mẫu DNA tổng số sau đó sẽ đƣợc kiểm tra chất lƣợng bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1% (mục 2.2.2.4) và đo quang phổ hấp thụ (OD) để kiểm tra hàm lƣợng và chất lƣợng DNA tổng số thu đƣợc.
2.2.2.2. Tách chiết RNA tổng số từ lúa
RNA tổng số đƣợc tách chiết từ lá lúa non theo quy trình hƣớng dẫn của hãng Invitrogen. Mẫu thực vật tƣơi đƣợc thu và bảo quản trong N2 lỏng cho tới khi tách chiết. 100 mg mẫu mô thực vật đƣợc nghiền thành bột mịn trong N2 lỏng và chuyển vào ống eppendorf 1,5 ml. Sau đó, 1 ml Trizol đƣợc bổ sung vào ống; ống đƣợc đảo đều và ủ trên đá trong 5 phút. Tiếp theo, 200 μl chloroform đƣợc bổ sung vào hỗn hợp; ống đƣợc lắc mạnh bằng máy vontex trong 15 giây, sau đó đƣợc ủ trên đá trong 15 phút. Ống đƣợc ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong 5 phút, ở 4oC. Dịch nổi đƣợc chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới. 500 μl isopropanol đƣợc bổ sung vào dung dịch; ống đƣợc ủ trên đá trong 15 phút để kết tủa RNA. Kết tủa đƣợc thu lại bằng cách ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút, trong 15 phút, ở 4oC và đƣợc rửa lại trong 1 ml ethanol 70%. Ống đƣợc lắc mạnh trong 15 giây, sau đó đƣợc ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 10 phút, ở 4oC. Dịch nổi bị loại bỏ và kết tủa đƣợc làm khô trong 1 giờ. Kết tủa RNA cuối cùng đƣợc hòa tan lại
2.2.2.3. Tách chiết DNA plasmid
DNA tái tổ hợp đƣợc tinh sạch từ tế bào vi khuẩn E. coli bằng bộ kit GenJETTM Plasmid Miniprep (Fermentas). Một khuẩn lạc dƣơng tính đƣợc ni lắc trong 5 ml mơi trƣờng LB lỏng có bổ sung chất kháng sinh với tốc độ 220 vòng/phút ở 37°C qua đêm. Tế bào đƣợc thu bằng cách ly tâm ở vận tốc 6.000 vòng/phút trong 10 phút, ở 4oC, sau đó đƣợc hòa trở lại trong 250 μl đệm P1 (Resuspension solution) đã bổ sung enzyme RNAse A. 250 μl đệm P2 (Lysis solution) đƣợc bổ sung vào dịch tế bào. Hỗn hợp đƣợc ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút để phá vỡ tế bào giải phóng plasmid. Hỗn hợp sau đó đƣợc trung hòa bởi 350 μl đệm P3 (Neutralization solution). Mảnh vỡ tế bào và protein biến tính đƣợc loại bỏ bằng cách ly tâm hỗn hợp với vận tốc 13.000 vòng/phút trong 10 phút, ở 4°C. Dịch nổi sau khi ly tâm đƣợc đƣa lên cột tinh sạch plasmid và ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút. Plasmid đƣợc giữ lại trên lớp màng silica còn dịch qua cột đƣợc gạn bỏ. 500 μl đệm rửa (Wash buffer) đƣợc bổ sung và ly tâm 30-60 giây, sau đó gạn bỏ dịch qua cột. Bƣớc này đƣợc lặp lại một lần nữa. Cột tinh sạch chứa plasmid đƣợc chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới. 50 μl đệm đẩy (Elution buffer) đƣợc bổ sung vào chính giữa màng silica của cột và đƣợc ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút. Plasmid đƣợc thu bằng cách ly tâm ống với vận tốc 10.000 vòng/phút trong 1 phút. Mẫu DNA plasmid tinh sạch cuối cùng đƣợc bảo quản ở -20°C.
2.2.2.4. Điện di DNA/RNA trên gel agarose
DNA/RNA trong mẫu thí nghiệm đƣợc phát hiện và định lƣợng tƣơng đối bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose và nhuộm Ethidium bromide (EtBr) theo phƣơng pháp của Sambrook và Russel [88].
Điện di DNA: 1,0 g agarose đƣợc đun nóng trong 100 ml đệm TAE và
đúc vào khn. Sau khi gel đơng hồn toàn, hỗn hợp mẫu gồm 5 l mẫu DNA đƣợc trộn với 1 l đệm mẫu có chứa chất chỉ thị màu là bromophenol xanh, xylene cyanol và EtBr ở nồng độ 50 g/l đƣợc tra vào các giếng trên bản gel. Mẫu đƣợc điện di với hiệu điện thế ổn định là 10 V/cm gel đến khi vạch màu bromophenol xanh cách mép gel 2 cm thì dừng lại. Sau đó, gel đƣợc lấy ra và soi dƣới ánh sáng tử ngoại của máy soi gel, các băng gắn với EtBr xuất hiện dƣới dạng các băng màu sáng trên nền gel màu đen.
Điện di RNA: 1,8 g agarose đƣợc đun nóng để hòa tan trong 170 ml
H2O, sau đó làm mát về 65o
C. 10 ml formaldehyde (37%) và 20 ml đệm MOPS 10 X đƣợc bổ sung vào dung dịch, lắc đều và đổ vào khuôn đúc gel. Sau khi gel đƣợc chuẩn bị, 10 μl RNA đƣợc trộn với 20 μl đệm mẫu RNA (có chứa formamide, formaldehyde, EtBr) và ủ ở 65oC trong 5 phút, sau đó đƣợc làm mát trên đá. Trƣớc khi tra mẫu điện di, gel đƣợc điện di khởi động ở hiệu điện thế 5 V/cm trong 5 phút. Mẫu đƣợc trộn với 2 μl đệm có chứa chất chỉ thị màu bromophenol xanh, sau đó đƣợc tra vào giếng và điện di với hiệu điện thế 100 V trong 10 phút và 65 V trong 90 phút. Sau đó, gel đƣợc lấy ra và soi dƣới ánh sáng tử ngoại của máy soi gel, các băng gắn với EtBr xuất hiện dƣới dạng các băng màu sáng trên nền gel màu đen.
2.2.3. Sinh tổng hợp DNA bổ sung hoàn chỉnh (full-length cDNA)
cDNA hoàn chỉnh đƣợc chúng tôi sinh tổng hợ p tƣ̀ RNA tổng số thu đƣợc tƣ̀ mục 2.2.2.2 bằng bộ hóa chất GeneRacer TM
Kit của hãng Invitrogen theo đúng quy trình của hãng
(https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/generacer_man.pdf). Quy trình thí nghiệm (Hình 2.1) có thể tóm tắt gồm 4 bƣớc chính nhƣ sau: Đầu tiên tiến hành loại bỏ gốc PO4 ở đầu 5’ của các phân tƣ̉ không phải
RNA thông tin trƣởng thành (không có mũ m7G-p-p-p ở đầu 5’) bằng enzyme calf intestinal phosphatase (CIP). Tiếp đó loại bỏ mũ ở đầu 5’ của RNA thơng tin trƣởng thành bằng enzyme có nguồn gốc tƣ̀ cây t huốc lá - tobacco acid pyrophosphatase (TAP). Gắn các RNA thông tin trƣởng thành với một đoạn RNA cung cấp theo bộ hóa chất nhờ enzyme RNA ligase . Trong phản ƣ́ng này do chỉ có RNA thông tin trƣởng thành còn mang gốc PO 4 nên chỉ có loại RNA này có thể gắn đƣợc với đoạn RNA cung cấp theo bộ hóa ch ất. Bƣớc cuối cùng, thƣ̣c hiện phản ƣ́ng phiên mã ngƣợc (Reverse transcriptase) với cặp mồi gồm mồi xuôi bám đặc hiệu trên vùng RNA của bộ kit và mồi ngƣợc là mồi oligodT bám vào vùng polyA của RNA thông tin . Phản ứng đƣợc thực hiện với enzyme phiên mã ngƣợc SuperScript™ III RT. cDNA hoàn chỉnh thu đƣợc tƣ̀ phản ƣ́ng trên sẽ đƣợc lƣu trƣ̃ ở -20oC và đƣợc sƣ̉ dụng làm khn nhân bản các trình tự mong muốn trong các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 2.1 | Giản đồ miêu tả kỹ thuật sinh tổng hợp sợi phân tử cDNA sợi 1 của mRNA
trƣởng thành (GeneRacerTM
2.2.4. Nhân bản đoạn DNA đặc hiệu bằng kĩ thuật PCR
Các đoạn gen đƣợc nhân bản từ khuôn DNA tổng số hoặc cDNA của lúa bằng kỹ thuật PCR thơng thƣờng [88]. Theo đó, tùy từng loại khn và đặc điểm đoạn cần nhân bản phản ứng đƣợc tiến hành tối ƣu hóa điều kiện phản ứng với máy nhân gen gradient với ít nhất 06 điều kiện nhiệt độ để tìm đƣợc điều kiện tối ƣu. Tiếp đó, lƣợng khn thích hợp sẽ đƣợc tối ƣu hóa để có thể thu đƣợc sản phẩm đặc hiệu (đơn băng, ít nhiễu tạp...) đáp ứng yêu cầu cho các phản ứng nhân dòng, sàng lọc tiếp theo.
2.2.4.1. Tinh sạch DNA từ gel agarose
Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch từ gel agarose bằng bộ kit GenJETTM Gel Extraction (Fermentas) theo quy trình hƣớng dẫn. Băng DNA quan tâm đƣợc cắt chính xác từ gel agarose và đƣa vào ống eppendorf 1,5 ml. Đệm bám (Binding buffer) đƣợc bổ sung vào ống (1 µl đệm ~ 1 mg gel); ống đƣợc ủ ở 60°C trong khoảng 10 phút đến khi gel tan hoàn toàn. Dung dịch gel agarose đã hòa tan đƣợc chuyển lên cột tinh sạch và ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 1 phút. 500 µl đệm rửa (Wash buffer) đƣợc bổ sung vào cột và ly tâm trong 1 phút ở vận tốc 10.000 vòng/phút. Bƣớc rửa cột đƣợc lặp lại một lần nữa. 100 µl đệm đẩy (Elution buffer) đƣợc bổ sung vào chính giữa lớp màng silica của cột. DNA đƣợc thu bằng cách ly tâm cột trong 1 phút ở tốc độ 10.000 vòng/phút. Mẫu DNA tinh sạch đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose (mục 2.2.2.4) và đƣợc bảo quản ở -20°C.
2.2.4.2. Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector nhân dòng
Cả sản phẩm PCR và vector pUC19 đều đƣợc cắt bởi BamHI. Tuy