THỰC VẬT
1.3.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens
Vi khuẩn A. tumerfaciens là vi khuẩn gây bệnh sống trong đất, có khả năng
xâm nhiễm thực vật, kích thích tạo khối u ngay tại các vết thƣơng của cây chủ.A.
tumefaciens có chứa một plasmid lớn kích thƣớc khoảng 200 kb gọi là Ti-plasmid
(tumor inducing plasmid) chính là tác nhân truyền bệnh cho cây.
Cấu trúc và chức năng Ti-plasmid: Ti-plasmid đƣợc phát hiện ở tất cả các chủng A.tumefaciens gây nhiễm và tồn tại bền vững ở nhiệt độ dƣới 300C. Đ y là một phân tử DNA dạng mạch vòng, sợi k p và sao ch p độc lập, có kích thƣớc khoảng 200 kb. Phân tích di truyền cho thấy, Ti-plasmid dạng octopin và dạng nopalin là hai dạng phổ biến nhất, có 4 v ng tƣơng đồng, trong đó v ng T-DNA vàv ng g yđộc(Virulence Region-vùng Vir) liên quan trực tiếp tới sự hình thành khối u ở thực vật. V ng g y độc có chứa các gen mã hóa các protein/enzyme Vir. Các loại protein Vir là A, B, C, G, B1-11, D1-2, E1-2, F, H, J/AcvB. Các protein Vir này có vai trị quan trọng trong việc chuyển T-DNA sang tế bào thực vật. Hai vùng còn lại chứa gen mã hóa cho việc sao chép plasmid và chuyển nạp. Trên Ti- plasmid, chỉ có vùng T-DNA đƣợc chuyển từ vi khuẩn sang hệ gen của các cây chủ và tồn tại bền vững trong đó. Tuy nhiên, vùng này lại khơng mã hóa những sản phẩm trung gian cho quá trình chuyển T- DNA mà cần có sự trợ giúp đặc biệt của các gen gây khối u nằm trên vùng VIR và trên nhiễm sắc thể vi khuẩn (chv genes). Vùng VIR dài khoảng 40 k đảm nhiệm chức năng g y nhiễm. Ở Ti-plasmid dạng octopin, vùng VIR chứa tới 24 gen g y độc. Sản phẩm protein do các gen này mã hóa đã kích thích sự tách biệt T-DNA, bao bọc che chở và giúp chúng tiếp cận với
genome cây chủ [63].
Cấu trúc và chức năng T-DNA: T-DNA đƣợc giới hạn bởi một đoạn trình tự
lặp lại gần nhƣ hồn tồn khoảng 25 bp và gọi là đoạn biên. Chúng là dấu hiệu nhận biết cho quá trình chuyển T-DNA và xâm nhập của T-DNA vào tế bào thực vật. Ở đoạn biên bên phải (Right border-RB) có yếu tố điều khiển cis cần cho quá trình chuyển T-DNA. Đoạn biên bên trái (Left border - LB) gián tiếp tham gia vào quá trình chuyển T-DNA và là dấu hiệu để quá trình này kết thúc ình thƣờng [100]. Ti- plasmid dạng nopalin, T-DNA xâm nhập vào hệ gen thực vật một đoạn gen liên tục dài 22 kb. Trong khi, Ti-plasmid dạng octopin, T-DNA là một đoạn gen liên tục dài 13 kb. T-DNA mang nhiều gen nhƣ: 1 các gen mã hóa những enzyme cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opin; (2) các gen gây khối u nhƣ tms1, tsm2, tmr mã hóa cho các enzyme liên quan đến q trình sinh tổng hợp auxin và cytokinin [63].
1.3.2. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens
Các tế bào cây bị tổn thƣơng sẽ tiết ra các hợp chất dẫn dụ vi khuẩn nhƣ: phenolic (cacbolic acid), acetosyringone (AS), hydroxy acetosyringone (OH-AS), flavonoid, đƣờng đơn hoặc các tín hiệu khác nhƣ pH axit pH5 - 5,5 , đói phosphat và opine... Dƣới tác dụng của các hợp chất dẫn dụ hoặc các tín hiệu này, A. tumefaciens nhận biết rồi bám vào thành tế bào chủ và chuyển T-DNA vào tế bào
thực vật. Quá trình này đƣợc sự trợ giúp đặc biệt của các gen vir và RB, LB. Cũng chính các hợp chất và tín hiệu này với vai trị cảm ứng giúp cho các gen vùng VIR hoạt động và tăng cƣờng biểu hiện.
Hoạt động của các gen Vir kích thích sinh tổng hợp sợi đơn T-DNA. Chỉ
đoạn sợi đơn DNA giữa hai trình tự biên (LB và RB) của T-DNA mới đƣợc chuyển vào tế bào thực vật và đƣợc gắn vào hệ gen của tế bào. Protein VirD1, D2 là các endonuclease nhận ra trình tự biên T-DNA và cắt sợi đơn tái bản tại mỗi biên. Sau đó, protein VirD2 vẫn cịn gắn kết với đầu cuối 5’ của sợi T-DNA, đồng thờiprotein VirE2 lập tức gắn vào sợi đơn, tạo phức hợp protein-DNA. Sự phối hợp này giúp
ngăn cản sự gắn lại với Ti-plasmid, giúp sợi đơn T-DNA duỗi thẳng làm giảm kích thƣớc của phức xuống xấp xỉ 2nm, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình di chuyển qua các kênh dẫn truyền trên màng tế bào [57]. Protein VirE2 và VirD2 chứa đựng tín hiệu định vị đặc hiệu cho phép phức hệ đi qua màng nh n và gắn vào DNA thực vật một cách ngẫu nhiên ở những chỗ gãy trên sợi của DNA của tế bào thực vật [57]. Protein VirD4 cũng là nhân tố bắt buộc đối với sự vận chuyển phức ss-T- DNA. Chức năng của protein VirD4 là liên kết với ATP độc lập với phức protein cần thiết với quá trình di truyền T-DNA [49]. VirB mã hóa cho các protein VirB, các protein này giống nhƣ kênh protein xuyên màng tạo nên một lỗ hổng, qua lỗ này phức hệ DNA-protein đƣợc vận chuyển vào thực vật [23].
1.3.3. Hệ thống vector/promoter dùng trong chuyển gen thực vật
1.3.3.1. Hệ thống vector biến nạp gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
Vi khuẩn A.tumefaciens đƣợc sử dụng để chuyển DNA ngoại lai vào tế bào
thực vật. Từ trình tự của Ti-plasmid của vi khuẩn A.tumefacien, nhiều vector biến nạp đƣợc phát triển. Các vector này dựa trên trình tự của Ti-plasmid đã đƣợc loại bỏ các trình tự gen không quan trọng, đƣợc lắp ghép thêm các gen cần thiết,... Nhờ vậy, cây trồng đƣợc biến nạp Ti-plasmid cải biến vừa mang gen quan tâm, vừa có khả năng tái sinh và phát triển ình thƣờng. Hai hệ thống vector chuyển gen hiệu quả, đƣợc sử dụng phổ biến là hệ vector nhị phân (binary vector) và hệ vector liên hợp (co-intergrative vector) [17, 145].
Hệ vector nhị phân (binary vector): Hệ thống vector nhị phân có vùng T- DNA và vùng VIR nằm trên hai plasmid khác nhau nhƣng trong c ng một chủng A.
tumefaciens [17, 145].
Hệ vector liên h p (co-intergrative vector): Vector liên hợp đƣợc xây dựng trên cơ sở sự tái tổ hợp giữa v ng tƣơng đồng nằm trên plasmid vi khuẩn nhƣ vector của E.coli) với vùng T-DNA trên Ti-plasmid của A. tumefaciens. Trong đó, v ng VIR đƣợc giữ lại, vùng mã hóa chức năng g y khối u bị loại bỏ và thay thế
1.3.3.2. Promoter sử dụng trong chuyển gen thực vật
Stress sinh học và phi sinh học là nguyên nhân chính làm giảm năng suất trên nhiều đối tƣợng cây trồng quan trọng nhƣ lúa, ngơ, ơng, lúa mì, cà chua... Và để đối phó với vấn đề này, cơng nghệ chuyển gen thực vật đƣợc sử dụng và đƣợc coi là một công cụ hiệu quả để chuyển các gen ngoại lai nhằm cải thiện nguồn gen cây trồng. Trong phƣơng pháp này, việc lựa chọn sử dụng các promoter khác nhau để kiểm soát mức độ biểu hiện của gen ngoại lai là rất quan trọng [124].
Promoter là các trình tự nucleotide nằm ở phía đầu 5’ của vị trí khởi đầu phiên mã gen, đóng vai trị điều khiển q trình phiên mã nhờ khả năng đảm bảo các vị trí nhận biết cho các protein tham gia vào việc biểu hiện gen nhƣ enzyme RNA polymease, các yếu tố phiên mã. Về cơ ản, promoter đóng vai trị nhƣ một công tắc bật gen. Nhƣng cơ chế hoạt động không đơn giản nhƣ một công tắc điện. Thay vào đó, promoter chứa đựng nhiều modul khác nhau hoạt động nhƣ các cảm biến, cho phép chúng phản ứng với những tín hiệu từ những gen khác hoặc từ mơi trƣờng, định rõ khi nào thì gen biểu hiện và biểu hiện ở đ u, với cƣờng độ và thời gian nhƣ thế nào. Nói chung, vai trị của promoter cho phép gen hoạt động đúng trong các chu trình điều hịa hết sức phức tạp của sinh vật [1, 124]. Về mặt cấu trúc, promoter có cấu trúc phức tạp gồm nhiều yếu tố đặc trƣng có chức năng gắn/liên kết với các yếu tố protein vào quá trình phiên mã gen. Các yếu tố này đƣợc gọi là các yếu tố cis (cis element). Mỗi yếu tố cis đƣợc đặt tên dựa trên trình tự nucleotide của chúng. Yếu tố cis cơ ản nhất là hộp TATA (TATA box). Hộp này chịu trách nhiệm giúp cho quá trình gắn RNA polymerase chính xác vào vị trí khởi đầu phiên mã gen. Yếu tố cis cơ ản thứ hai là hộp CAAT (CAATbox) cung cấp vị trí gắn cho
RNA polymerase. Ngồi hai trình tự cơ ản này, hầu hết promoter của sinh vật nhân chuẩn có chứa thêm yếu tố điều hịa khác là các trình tự DNA nằm phía trƣớc vị trí khởi động phiên mã, tham gia q trình điều hịa hoạt động của gen. Những trình tự điều hòa đƣợc biết rộng rãi là các v ng tăng cƣờng [1, 124].
Tùy thuộc vào hoạt động, promoter đƣợc chia làm 3 nhóm chính, bao gồm promoter cơ định, promoter đặc hiệu mô và promoter cảm ứng. (i) Promoter cơ định (constitutive promoter) đƣợc sử dụng khi muốn gen đƣợc biểu hiện ở tất cả các mô khác nhau trong hầu hết các giai đoạn phát triển của thực vật. Promoter CaMV35S
đƣợc phân lập từ vi rút khảm súp lơ là một ví dụ điển hình của nhóm promoter này. Promoter CaMV35S là trình tự có kích thƣớc khoảng 350bp, chứa 3 vùng chức năng cơ ản gồm hộp TATA và 2 vùng chức năng tăng cƣờng. Loại promoter này hoạt động rất mạnh ở hầu hết tất cả các loại tế bào/mô thực vật, trong mọi giai đoạn phát triển, đặc biệt là ở đối tƣợng cây hai lá mầm. Chính vì vậy, promoter CaMV35S là cấu trúc đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong nghiên cứu chuyển gen thực vật, chiếm tới hơn 80% số lƣợng thực vật chuyển gen [68]. (ii) Promoter đặc hiệu mô (tissue specific promoter) đƣợc sử dụng khi muốn điều khiển biểu hiện gen tại một hoặc một vài mô nhất định tại một hoặc một vài giai đoạn phát triển. Ở lúa, gen mã hóa enzyme sucrose synthase 1 biểu hiện đặc hiệu ở bó mạch, rễ, mầm. Promoter Rsuc1 ngoài chứa các trình tự đặc trƣng nhƣ hộp TATA, hộp CCAAT và các trình tự đặc hiệu quyết định biểu hiện đặc hiệu bó mạch nhƣ hộp ASL, hộp GATA... [155]. (iii) Promoter cảm ứng (inducible promoter) đƣợc sử dụng để điều khiển biểu hiện một gen ở những điều kiện môi trƣờng nhất định nhƣ hóa chất, hormone, điều kiện stress sinh học và phi sinh học.Các gen đƣợc điều khiển biểu hiện bởi các promoter cảm ứng trong một mô, một cơ quan cụ thể ở điều kiện xác định. Vùng promoter cảm ứng ngoài mang các trình tự cis cơ ản, cịn chứa đựng một số yếu tố điều hòa
cis khác nhau (cis-acting elements tƣơng tác với nhiều nhân tố phiên mã điều
khiển quá trình phiên mã) khác nhau, giúp gen biểu hiện dƣới điều kiện môi trƣờng nhất định. Rd29A là một promoter cảm ứng với các điều kiện môi trƣờng bất lợi nhƣ hạn, mặn và lạnh. Các nghiên cứu trƣớc đã chỉ ra rằng, trình tự promoter Rd29A chứa vùng có hoạt tính cis liên quan đến sự biểu hiện dƣới điều kiện bất lợi của môi trƣờng là v ng đáp ứng ABA (the ABA-responsive element (ABRE)), vùng cảm ứng mất nƣớc (the
dehydration – responsive element (DRE)/C-repeat (CRT) [150].
Trong công nghệ chuyển gen thực vật, chọn lọc 1 promoter là yếu tố quyết định cho sự thành công trong chuyển gen và biểu hiện gen. Do đó, kết hợp vùng mã hóa một gen với một promoter thích hợp có thể cải thiện, điều chỉnh mức độ, thời gian và vị trí biểu hiện của gen ngoại lai.