Ghi chú: Sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc được điện di trên gel agarose 1%. (A) PCR
khuẩn lạc được biến nạp pGEM/OsNAC1; giếng 1: đối chứng âm (khuẩn lạc không được biến nạp); giếng 2: đối chứng dương (khuôn là cDNA c a lúa Tẻ Đỏ xử lý hạn); giếng 3-
8:khuôn là các khuẩn lạc trắng số 1-6. (B) PCR khuẩn lạc được biến nạp
pGEM/OsNAC5;giếng 1-8: khuôn là các khuẩn lạc trắng số 1-8; giếng 9: đối chứng dương; giếng 10:đối chứng âm. (C) PCR khuẩn lạc được biến nạp pGEM/OsNAC10;giếng 1:đối chứng âm; giếng 2: đối chứng dương; giếng 3-9: khuôn là khuẩn lạc trắng số 1-7. Giếng M: thang chuẩn DNA 1kb.
Khuẩn lạc dƣơng tính cho mỗi gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 đƣợc chọn để nuôi cấy, tách chiết DNA và sau đó kiểm tra bằng hai phƣơng pháp PCR và cắt enzyme giới hạn.
Kết quả điện di sản phẩm PCR trên Hình 3.4 cho thấy sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho các ăng DNA đúng với tính tốn lý thuyết của từng gen, lần lƣợt là 951 bp (Hình 3.4A, giếng 1), 990 bp (Hình 3.4B, giếng 4) và 1,2 kb (Hình 3.4C, giếng 1). Đối với sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi vector, kết quả thu đƣợc một ăng DNA có kích thƣớc lần lƣợt ~1,1 kb (Hình 3.4A, giếng 3), ~1,2 kb (Hình 3.4B, giếng 2) và ~1,4 kb (Hình 3.4C, giếng 3). Các kích thƣớc này hồn tồn phù hợp với kích thƣớc đoạn DNA theo tính tốn lý thuyết, bao gồm kích thƣớc nguyên bản của đoạn gen đích đƣợc chèn vào cộng với 186 bp của đoạn trình tự DNA nằm trên vector pGEM-T. Ngƣợc lại, đối với các phản ứng đối chứng âm không sử dụng DNA khuôn, kết quả điện di không thu đƣợc ăng DNA nào Hình 3.4A, giếng 2 và 4; Hình 3.4B, giếng 1 và 3; Hình 3.4C, giếng 2 và 4).
Hình 3.4: Kiểm tra plasmid tái tổ h p bằng PCR
Ghi chú: Sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp được điện di trên gel agarose 1%.(A) PCR
pGEM/OsNAC1, giếng 1 và 2: PCR với cặp mồi OsNAC1-Fw/OsNAC1-Rv; giếng 3 và 4:PCR với cặp mồi T7-Pro/SP6-Pro; giếng 1 và 3: khuôn là pGEM/OsNAC1; giếng 2 và 4: đối chứng âm (khơng có DNA khn). (B) PCR pGEM/OsNAC5, giếng 1 và 2: PCR với cặp mồi T7-Pro/SP6-Pro; giếng 3 và 4:PCR với cặp mồi OsNAC5-Rv/OsNAC5-Fw; giếng 2 và 4: khuôn là pGEM/OsNAC5; giếng 1 và 3: đối chứng âm (khơng có DNA khn). (C) PCR pGEM/OsNAC10, giếng 1 và 2: PCR với cặp mồi OsNAC10-Rv/OsNAC10-Fw; giếng 3 và 4: PCR với cặp mồi T7-Pro/SP6-Pro; giếng 1 và 3: khuôn là pGEM/OsNAC10; giếng 2 và 4: đối chứng âm (khơng có DNA khn).Giếng M: thang chuẩn DNA 1kb.
Để khẳng định chắc chắn hơn sự có mặt của đoạn DNA đích trong vector tái tổ hợp. Plasmid tinh sạch tiếp tục đƣợc kiểm tra bằng enzyme cắt giới hạn EcoRI có
hai vị trí nhận biết trên pGEM-T ở 2 đầu của đoạn DNA đƣợc chèn vào (Phụ lục 3).
Hình 3.5: Kiểm tra plasmid tái tổ h p bằng enzyme cắt giới hạn
Ghi chú: Sản phẩm cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp pGEM/OsNAC1 (A), pGEM/OsNAC5
(B) và pGEM/OsNAC10 (C) bằng EcoRI được điện di trên gel agarose 1%. Giếng 1: plasmid tái tổ hợp nguyên bản, giếng 2: sản phẩm cắt giới hạn, giếng M: thang chuẩn DNA 1kb.
Sản phẩm phản ứng cắt giới hạn pGEM/OsNAC1, pGEM/OsNAC5 và pGEM/OsNAC10 khi đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% đều cho 2 ăng DNA, trong đó ăng DNA thứ nhất có kích thƣớc khoảng 3,0 kb là bộ khung nguyên bản của vector pGEM-T và ăng DNA thứ hai có kích thƣớc lần lƣợt tƣơng ứng với kích thƣớc lý thuyết là 951bp (Hình 3.5A, giếng 2), 990bp (Hình 3.5B, giếng 2) và 1,2 kb (Hình 3.5C, giếng 2 tƣơng ứng kích thƣớc tính tốn lý thuyết của 3 gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10. Các kết quả thu đƣợc chứng tỏ các gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 từ lúa đã nh n dịng thành cơng vào vector pGEM-T.
Giải trình tự gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC
Để xác định các đoạn gen đã đƣợc phân lập từ giống lúa Tẻ Đỏ có đúng là các gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 mong muốn hay không, các vector tái tổ
hợp đƣợc giải trình tự DNA, sử dụng mồi T7-Pro và SP6-Pro. Kết quả giải trình tự sau đó đƣợc xử lý bằng phần mềm BioEdit 2.0 và phân tích bằng phần mềm Genetyx 4.0.
Kết quả giải trình tự gen cho thấy, kích thƣớc của 3 đoạn DNA đƣợc phân lập từ giống lúa Tẻ Đỏ lần lƣợt là 951 bp, 993 bp và 1182 bp. Các đoạn DNA này có trình tự Nu giống 99%, 98% và 92% so với gen OsNAC1 (AY596808.1),
OsNAC5 (AB028184.1) và OsNAC10 (AK069257.1) của giống lúa Nipon are đã đƣợc công bố trên Ngân hàng Gen thế giới. Trình tự OsNAC1 của lúa Tẻ Đỏ có 12 vị trí sai khác, nằm rải rác từ đầu 3’ đến đầu 5’ (Phụ lục 6) so với gen đã công bố; OsNAC5 phân lập đƣợc sai khác 17 vị trí Nu so với OsNAC5 của lúa Nipon are, trong đó có 2 vị trí thay thế nucleotit nằm phía đầu 3’, 15 vị trí sai khác cịn lại đều nằm phía đầu 5’ của gen. Đặc biệt, trên OsNAC5 của lúa Tẻ Đỏ có 2 vị trí sai khác lớn là mất ba Nu ở vị trí 577-579 (GTG) và thêm 6 Nu ở vị trí 802-807 (GACTAC) (Phụ lục 7). Trình tự gen OsNAC10 đã nh n dịng có sự sai khác lớn nhất so với trình tự đã cơng ố (53 vị trí), trong đó nhiều vị trí sai khác lớn tập trung ở đầu 5’ của gen (Phụ lục 8).
Kết quả phân tích trình tự axit amin suy diễn của các gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 của lúa Tẻ đỏ cho thấy, cả 3 gen phân lập đƣợc đều mã hóa cho protein với các domain đặc trƣng của họ protein NAC. OsNAC1, OsNAC5 chứa đầy đủ cả 5 domain bảo thủ A, B, C, D và E, trong khi OsNAC10
thiếu domain E (Hình 3.6). Ngồi ra, cả ba protein này đều chứa một vùng tín hiệu định vị nhân PRDRKYP phổ biến cho các nhân tố phiên mã, nằm ở domain C (Hình 3.6). Kết quả này hoàn tồn phù hợp với các cơng bố trƣớc đ y về cấu trúc protein của các nhân tố phiên mã nhóm NAC [67, 75, 79, 136]. Nhƣ vậy, trình tự các gen
OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 phân lập từ giống lúa Tẻ Đỏ mặc dù có một số sai khác so với các gen đã đƣợc nghiên cứu và công bố nhƣng các sai khác chủ yếu tập trung ở phía đầu 5’ của gen và khơng gây ảnh hƣởng đến các domain đặc trƣng và quan trọng của nhân tố phiên mã NAC, do đó có thể không gây ảnh
hƣởng tới chức năng điều hịa phiên mã của các gen này.
Hình 3.6: Phân tích trình tự axit amin suy diễn của protein OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 của giống lúa Tẻ đỏ
Ghi chú:Vùng tín hiệu định vị nhân được kí hiệu bởi dấu ngoặc []; các vùng bảo th c a
protein NAC được kí hiệu A, B, C, D, E; (TĐ): gen phân lập từ lúa Tẻ Đỏ, (JA): gen phân lập từ lúa Japonica (Niponbare) đã công bố trên Ngân hàng gen mã số AY596808.1 (OsNAC1), AB028184.1 (OsNAC5) và AK069257.1 (OsNAC10).
3.1.3. Phân tích biểu hiện của OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 trong điều kiện hạn
Để đánh giá mức độ biểu hiện của các gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 trong cây lúaTẻ Đỏ ở điều kiện stress hạn, cây lúa non ba tuần tuổi đƣợc xử lý hạn giả định bằng cách ngâm rễ trong dung dịch PEG 20%. RNA tổng số của các mẫu
lúa đã xử lý hạn với khoảng thời gian khác nhau đƣợc tách chiết và sử dụng cho thí nghiệm phân tích án định lƣợng mRNA bằng kỹ thuật RT-PCR. Mẫu RNA tách chiết từ cây lúa ở thời điểm chƣa xử lý stress đƣợc sử dụng làm mẫu đối chứng âm. Trong thí nghiệm này, gen Actin đƣợc sử dụng làm gen nội chuẩn để so sánh tƣơng
quan giữa các mẫu phân tích.
Kết quả phân tích biểu hiện gen bằng RT-PCR cho thấy cả 3 gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 đều biểu hiện ở các thời điểm xử lý hạn khác nhau (Hình
3.7A, giếng 2-6), tuy nhiên mức độ biểu hiện của các gen ở các thời điểm xử lý stress hạn có sự khác nhau rõ rệt, thể hiện ở độ đậm và kích thƣớc sản phẩm PCR thu đƣợc. Kết quả phân tích bằng phần mềm ImageJ cho thấy các gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 có sự thay đổi mức độ biểu hiện rõ rệt theo thời gian trong
suốt giai đoạn xử lý cây với điều kiện stress hạn giả định (Hình 3.7B). Đối với
OsNAC1, mức độ biểu hiện của gen tăng chậm, thể hiện ở số lƣợng bản sao của
OsNAC1 tại thời điểm 1 giờ sau xử lý hạn không thay đổi rõ rệt so với thời điểm
không xử lý stress hạn. Tuy nhiên, sau 6 giờ, mức độ biểu hiện của gen OsNAC1 tăng rất nhanh và đạt đỉnh sau 12 giờ tăng ≥ 20 lần , sau đó giảm dần. Đối với OsNAC5, hàm lƣợng mRNA thay đổi khá nhanh, tăng ~ 15 lần chỉ sau 1 giờ và đạt đỉnh sau 6 giờ (tăng gần ~ 20 lần), sau đó ắt đầu giảm dần về gần với trạng thái an đầu sau 24 giờ. Tƣơng tự với OsNAC10, mức độ biểu hiện của gen bắt đầu tăng đáng kể sau 1
giờ xử lý stress hạn và đạt đỉnh sau 6 – 12 giờ xử lý stress hạn. Các kết quả thu đƣợc này chứng tỏ quá trình phiên mã của các gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10
đƣợc điều hòa bởi yếu tố stress hạn. Đặc biệt, OsNAC1 có mức độ biểu hiện cao hơn rõ rệt và duy trì mức độ biểu hiện cao trong thời gian dài hơn đáng kể so với hai gen còn lại. Điều này cho phép dự đốn OsNAC1 đóng góp vai trị nhiều hơn trong đáp ứng chống chịu hạn của cây lúa Tẻ Đỏ so với OsNAC5 và OsNAC10, đặc biệt là đối với stress hạn kéo dài. Chính vì vậy, OsNAC1 đƣợc lựa chọn làm đối tƣợng nghiên cứu chính cho các thí nghiệm tiếp theo nhằm tạo ra dòng lúa
chuyển gen có khả năng chống chịu hạn.
Hình 3.7: Biểu hiện của OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 trong điều kiện hạn
Ghi chú: Mức độ biểu hiện c a OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 ở cây lúa Tẻ Đỏ xử lý hạn (PEG20%) trong thời gian 0 giờ, 1 giờ, 6 giờ, 12 giờ và 24 giờ được xác định bằng kỹ
thuật RT-PCR bán định lượng. (A) Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1%. (B)
Đồ thị so sánh tương quan mức độ biểu hiện c a OsNAC1 (cột màu đỏ), OsNAC5 (cột màu xanh) và OsNAC10 (cột màu vàng). (-): đối chứng âm (phản ứng PCR khơng có DNA khuôn). Mức độ biểu hiện gen tại thời điểm chưa xử lý stress (0 h) có giá trị bằng 1. Actin được sử dụng làm gen nội chuẩn.
Các nghiên cứu phân tích biểu hiện gen nói chung và nghiên cứu biểu hiện gen mã hoá nhân tố phiên mã nói riêng đƣợc thực hiện bằng nhiều phƣơng pháp khác
nhau nhƣ lai RNA, định lƣợng Realtime-PCR và án định lƣợng RT-PCR. Trong đó, phƣơng pháp án định lƣợng RT-PCR đã đƣợc sử dụng khá phổ biến trong các nghiên cứu biểu hiện gen trƣớc đ y, ao gồm cả các nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC [26, 40, 51]. Ví dụ, nhóm nghiêu cứu Kikuchi sử dụng phƣơng pháp RT-PCR nghiên cứu mức độ biểu hiện các gen nhóm NAC đã chỉ ra rằng, mức độ biểu hiện của các gen khác nhau trong nhóm mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC rất khác nhau ở giống lúa Komenoo. Trong nghiên cứu của KiKuchi,
OsNAC6 và OsNAC8 biểu hiện rất mạnh và gen OsNAC3 biểu hiện yếu ở tất cả các
mô. OsNAC5 chỉ biểu hiện mạnh ở rễ và phôi [79]. Ở giống lúa Nipponbare, trong
điều kiện xử lý stress hạn, các gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 có mức độ biểu hiện khác nhau ở các thời điểm khác nhau. OsNAC5 và OsNAC10 có mức độ biểu hiệu tăng dần và cao nhất tại thời điểm 2 giờ, giảm dần và thấp nhất tại thời điểm 6 giờ [75], OsNAC1 biểu hiện tăng dần và biểu hiện mạnh nhất tại thời điểm 24 giờ sau xử lý hạn [62]. Trong nghiên cứu này, khi xử lý stress hạn cây lúa Tẻ Đỏ, các gen
OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 cũng có mức độ biểu hiện khác nhau ở các thời điểm khác nhau. Tuy nhiên, khác với giống lúa Nipponbare, OsNAC5 và OsNAC10 của cây lúa Tẻ Đỏ có mức độ biểu hiệu tăng dần và cao nhất tại thời điểm 6 giờ, mức độ biểu hiện của OsNAC1 tăng rất nhanh sau 1 giờ và mạnh nhất tại thời điểm 12 giờ. Đặc biệt, mức độ và thời gian biểu hiện của gen OsNAC1 ở lúa Tẻ Đỏ mạnh và dài hơn so với hai gen OsNAC5 và OsNAC10.
3.2. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN OsNAC1 TRONG TẾ BÀO THỰC VẬT
3.2.1. Thiết kế vector biểu hiện OsNAC1 điều khiển bởi promoter hoạt động liên tục
Để phục vụ thí nghiệm nghiên cứu chuyển gen vào lúa, đề tài tiến hành thiết kế cấu trúc biểu hiện OsNAC1 điều khiển bởi promoter hoạt động liên tục Ubiquitin và 35S. Vector nhị ph n pBI101 nguyên bản đã đƣợc xử lý loại ỏ gen chỉ thị GUS
mang cấu trúc biểu hiện 35S:NosT (pBI-35S) và Ubi:NosT (pBI-Ubi) sử dụng cho nghiên cứu này.
3.2.1.1. Ghép nối đoạn gen OsNAC1 vào vector pBI-35S và pBI-Ubi
Trong thí nghiệm này, vector pGEM/OsNAC1, vector pBI-35S và pBI-Ubi đã đƣợc xử lý đồng thời với enzyme BamHI. Đoạn DNA kích thƣớc ~1,0 k tƣơng ứng với đoạn gen OsNAC1 và ~11 k tƣơng ứng với vector pBI-35S & pBI-Ubi mạch
thẳng thu đƣợc từ sản phẩm cắt giới hạn các vector đƣợc tinh sạch, ghép nối với nhau và biến nạp vào tế bào E. coli DH5α (Hình 3.8).
Hình 3.8: Xử lý vector pBI-Ubi, pBI-35S và pGEM/OsNAC1 bằng enzyme cắt giới hạn
Ghi chú: Sản phẩm cắt enzyme giới hạn BamHI được điện di trên gel agarose 1%. Giếng
1 và 2: pBI-Ubi; giếng 3 và 4: pBI-35S; giếng 5 và 6: pGEM/OsNAC1; giếng 2, 4 và 5: sản phẩm cắt giới hạn; giếng 1, 3 và 6: vector nguyên bản. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb.
Thể biến nạp dƣơng tính mang trình tự OsNAC1 đƣợc chọn lọc bằng phƣơng pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc, sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho promoter và OsNAC1 là Ubi-Fw/OsNAC1-Rv đối với vector pBI-Ubi) và 35S-
Fw/OsNAC1-Rv đối với vector pBI-35S). Theo lý thuyết, nếu đoạn gen
OsNAC1 đƣợc ghép nối đúng chiều vào vector chuyển gen pBI-Ubi và pBI-35S,
sản phẩm PCR thu đƣợc sẽ là một ăng DNA kích thƣớc khoảng 1,2 kb. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% cho phép chọn lọc đƣợc một số thể biến nạp có mang vector pBI-Ubi và pBI-35S chứa trình tự gen OsNAC1gắn
~1,2 kb (Hình 3.9A, giếng 2, 4-6; Hình 3.9B, giếng 1-6).
Hình 3.9: PCR trực tiếp khuẩn lạc mang pBI-Ubi/OsNAC1 và pBI- 35S/OsNAC1
Ghi chú: Sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc được điện di trên gel agarose 1%. (A) PCR
khuẩn lạc được biến nạp pBI-Ubi/OsNAC1, giếng 1: đối chứng âm (khuẩn lạc khơng có được biến nạp); giếng 2-6: khuẩn lạc số 1-5. (B) PCR khuẩn lạc được biến nạp pBI-
35S/OsNAC1, giếng 1-6: khuẩn lạc số 1-6; giếng 7: đối chứng âm (khuẩn lạc khơng có được biến nạp). Giếng M: thang chuẩn DNA 1kb.
3.2.1.2. Kiểm tra vector tái tổ hợp pBI-Ubi/OsNAC1 và pBI-35S/OsNAC1
Để khẳng định sự có mặt đoạn gen OsNAC1 trên vector tái tổ hợp trong các
thể biến nạp, DNA plasmid đƣợc tách chiết kiểm tra bằng PCR và phản ứng cắt enzyme giới hạn. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu của OsNAC1 cho thấy sự xuất hiện của ăng DNA có kích thƣớc đúng ằng kích thƣớc đoạn gen OsNAC1 là 951 bp (Hình 3.10A, giếng 1 và 5). Với cặp mồi đặc hiệu của khung vector cho thấy sự xuất hiện của các ăng DNA có kích thƣớc đúng với kích thƣớc lý thuyết, lần lƣợt là 1141 bp (Hình 3.10A, giếng 3) và 1118 bp (Hình 3.10A, giếng 7). Khi xử lý plasmid tái tổ hợp với enzyme BamHI, sản phẩm phản
ứng cho 2 ăng DNA trên ản điện di (Hình 3.10B, giếng 2 và 4 , trong đó có một ăng kích thƣớc ~1 k tƣơng ứng với đoạn gen OsNAC1, một ăng có kích thƣớc lớn hơn 10 k tƣơng ứng với bộ khung vector. Kết quả này chứng tỏ plasmid tái tổ hợp thu đƣợc có mang đoạn gen đích OsNAC1.
Hình 3.10: Kiểm tra plasmid tái tổ h p pBI-Ubi/OsNAC1 và pBI-35S/OsNAC1
Ghi chú: Sản phẩm PCR và cắt giới hạn được điện di trên gel agarose 1%. (A) PCR plasmid
tái tổ hợp; giếng 1 và 3: khuôn là pBI-Ubi/OsNAC1; giếng 5 và 7: khuôn là pBI-35S/OsNAC1; giếng 1, 2, 5 và 6: PCR với cặp mồi OsNAC1-Fw/OsNAC1-Rv; giếng 3 và 4: PCR với cặp mồi Ubi-Fw/OsNAC1-Rv; giếng 7 và 8: PCR với cặp mồi 35S-Fw/OsNAC1-Rv; giếng 2, 4, 6 và 8: