2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Đối tƣ ng nghiên cứu
Mẫu giống lúa J02 đƣợc mua từ Công ty Cổ phần giống – Vật tƣ nông nghiệp công nghệ cao Việt Nam;
10 mẫu giống lúa Việt Nam và giống lúa đối chứng IR64 (giống lúa có khả năng chịu hạn cao) (Phụ lục 9) do Trung tâm Tài nguyên thực vật – Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp.
2.1.2. Chủng vi sinh vật
Vi khuẩn Escherichia coli chủng DH5α đƣợc mua từ hãng Thermo Scientifics (Mỹ); vi khuẩn A. tumefaciens chủng LBA4404 đƣợc mua từ Công ty Clontech Laboratories (Mỹ).
2.1.3. Vector và oligonucleotide
Vector pBI-Ubi, pBI-35S, pCAM-Lip9 và pCAM-Rd29Ado nhóm nghiên cứu của PGS. TS. Phạm Xuân Hội (Bộ môn Bệnh học phân tử thực vật – Viện Di truyền nông nghiệp) thiết kế và cung cấp; vector pGEM-T mạch thẳng có đầu T đƣợc đóng gói kèm trong bộ kit pGEM®-T Easy Vector Systems của hãng Promega.
Các cặp oligonucleotide (Bảng 2.1) sử dụng làm mồi cho PCR đƣợc thiết kế dựa trên các trình tự đã đƣợc cơng bố trên GenBank và đƣợc đặt mua từ hãng Invitrogen (Mỹ) và Sigma (Mỹ).
Bảng 2.1: Trình tự cácoligonucleotide sử dụng trong nghiên cứu.
Tên mồi Trình tự Gen/vector
OsNAC10-Fw 5’-GGATCCATGCCGAGCAGCGGCGGCGC-3’ OsNAC10
OsNAC10-Rw 5’-GGATTCGGATCCCTACTGCATCTGCAG-3’ OsNAC10
OsNAC5-Fw 5’-GGATCCATGGAGTGCGGTGGT-3’ OsNAC5
OsNAC5-Rv 5’-GGATTCTTAGAACGGCTTCTG-3’ OsNAC5
OsNAC1 -Rv 5-’GGATCCTCAGAACGGGACCATGCCCA-3’ OsNAC1
T7-Pro 5’-AATACGACTCACTATAG-3’ pGEM-T
SP6-Pro 5’-TATTTAGGTGACACTATAG-3’ pGEM-T
35S-Fw 5’-CCC ACT ATC CTT CGC AA-3’ 35S
Lip9-Fw 5’-GCGAATAGTTCTTGCTGATC-3’ Lip9
Ubi-Fw 5’-CCCTGCCTTCATACGCTATT-3’ Ubiquitin
RD-Fw 5’-AAGCTTCGACTCAAAACAAACTTA-3’ RD29A
RD-Rv 5’-GGATCCAATCAAACCCTTTATTCC-3’ RD29A
NosT- Rv 5’-AGACCGGCAACAGGATTCAA-3’ Nos
GUS-Fw 5’-ATGGTAGAT CTGAGGGTAAA-3’ GUS
GUS-Rv 5’- TCACACGTGGTG GTGGTGGT-3’ GUS
NAC1-t-Fw 5’-GAACAACAGCAGCCTGTTCG -3’ OsNAC1
Actin-Fw 5’-TGATGGTGTCAGCCACACT-3’ Actin
Actin-Rv 5’-TGGTCTTGGCAGTCTCCATT-3’ Actin
Hyg-Fw 5’-AAACTGTGATGGACGACACCGT-3’ HPT
Hyg-Rv 5’-GTGGCGATCCTGCAAGCTCC-3’ HPT
Hyg-RT-Fw 5’-CGAAGAATCTCGTGCTTTCA-3’ HPT
Hyg-RT-Rv 5’-ATGCAAAGTGCCGATAAACA-3’ HPT
NAC1-RT- Fw 5’-AGAAGGCGCTCGTGTTCTAC-3’ OsNAC1
NAC1-RT- Rv 5’-CCTCCTCCTTCACCTCCTTC-3’ OsNAC1
2.1.4. Hóa chất
Các loại enzyme giới hạn, DNA T4 ligase, Dream TaqDNA polymerase, PfuDNA polymerase, thang chuẩn DNA 1 kb và bộ kit tinh sạch DNA plasmid GeneJET Plasmid Miniprep Kit đƣợcmua từ hãng Thermo Scientifics (Mỹ). Bộ kit
sinh tổng hợp cDNA và RT-PCR đƣợc mua từ Công ty Agilent Technologies (Mỹ). Bộ kit MESA Blue dùng cho phản ứng qRT-PCR đƣợc mua của hãng Eurogentec.
Các hóa chất sử dụng để tinh sạch RNA/DNA và các loại kháng sinh đƣợc mua từ hãng Invitrogen. Các hóa chất cơ ản sử dụng cho sinh học phân tử và nuôi cấy mô
đƣợc mua từ Công ty Sigma (Mỹ), Merk (Đức) và PhytoTechnology (Anh) đều đạt độ tinh khiết cần thiết.
2.1.5. Thiết bị
Máy PCR 9700 của hãng Perkin Elmer; hệ thống điện di DNA của hãng Biorad; máy ly tâm Universal 30RF của hãng Hettich, Biofuge 28RS của hãng Heraus; máy chụp ảnh huỳnh quang Firereader của hãng UVItec; hệ thống máy Real-time PCR Mx3005P của Công ty Applied Biosystem Mỹ .
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xử lý mẫu thực vật
2.2.1.1. Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống lúa Việt Nam
Bảng 2.2: Thang điểm đánh giá khả năng chịu hạn của cây lúa theo IRRI
Điểm Độ cuốn lá
0 Lá khỏe ình thƣờng
1 Lá bắt đầu cuốn (hình chữ V nơng) 3 Lá cuộn lại (hình chữ V sâu) 5 Lá cuốn hồn tồn (hình chữ U) 7 Mép lá chạm nhau (hình chữ O) 9 Lá cuộn chặt
Thí nghiệm đánh giá chịu hạn của các giống lúa Việt Nam và giống lúa đối chứng IR64 (giống đối chứng có khả năng chịu hạn cao đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp của IRRI [70]. Hạt lúa đƣợc ngâm ủ trong nƣớc ở 37o
C trong 2 ngày. Hạt lúa nảy mầm đƣợc trồng trong chậu nhựa trong 8 tuần. Sau đó, c y lúa đƣợc tiến hành ngừng tƣới nƣớc trong 2 tuần. Sau 2 tuần ngừng tƣới nƣớc, c y lúa đƣợc đánh giá theo thang điểm IRRI dựa trên chỉ tiêu độ cuốn lá (Bảng 2.2).
2.2.1.2. Xử lý cây lúa với các điều kiện stress giả định
Thí nghiệm xử lý stress giả định đối với c y lúa non đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp của Qin và nhóm nghiên cứu [110]. Hạt lúa Tẻ đỏ đƣợc ngâm ủ trong nƣớc ở 37o
MS ở điều kiện 28oC trong 2 tuần. Rễ cây lúa non đƣợc nhúng vào dung dịch MS có chứa PEG 20% (xử lý hạn) với khoảng thời gian khảo sát (0, 1, 6, 12 và 24 giờ), mẫu lúa đƣợc nhúng ngay vào nitơ lỏng và bảo quản tới khi tách chiết RNA. Mẫu tách chiết RNA đƣợc sử dụng trong thí nghiệm phân lập gen và nghiên cứu mức độ biểu hiện gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC.
2.2.1.3. Đánh giá khả năng chịu hạn của cây lúa chuyển gen
Thí nghiệm đánh giá khả năng chịu hạn của cây lúa chuyển gen đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp của Dubouzet và Tran [42, 141].
Hạt lúa đƣợc cho nảy mầm trên môi trƣờng MS khơng có chất kháng sinh đối với c y đối chứng khơng chuyển gen) và có chứa Hygromycin 50 mg/l đối với cây chuyển gen). C y lúa đƣợc trồng trong cốc đất đến khi đƣợc khoảng 3 tuần tuổi. Các mẫu thí nghiệm đƣợc trồng trong điều kiện không tƣới nƣớc liên tục đến khi mẫu đối chứng (cây khơng chuyển gen) có biểu hiện héo chết không thể phục hồi (2 tuần thì tƣới nƣớc trở lại ình thƣờng. Sau 1 tuần tƣới nƣớc trở lại, số cây phục hồi sinh trƣởng đƣợc đếm và ghi lại.
2.2.2. Tách chiết, định lƣ ng DNA/RNA
2.2.2.1. Tách chiết DNA plasmid
DNA tái tổ hợp đƣợc tinh sạch từ tế bào vi khuẩn E. coli bằng bộ kit
GenJETTM Plasmid Miniprep (Thermo Scientifics). Một khuẩn lạc dƣơng tính đƣợc
ni lắc trong 5ml LB lỏng có bổ sung chất kháng sinh với tốc độ 220 vòng/phút ở 37°C qua đêm. Tế ào đƣợc thu bằng cách ly tâm ở vận tốc 6.000 vòng/phút trong 10 phút, ở 4oC, sau đó đƣợc hịa trở lại trong 250 µl đệm P1 (Resuspension solution đã ổ sung RNase A. 250 µl đệm P2 (Lysis solution đƣợc bổ sung vào dịch tế bào. Hỗn hợp đƣợc ủ ở nhiệt độ phịng trong 5 phút, sau đó đƣợc trung hịa bởi 350 µl đệm P3 (Neutralization solution). Mảnh vỡ tế bào và protein biến tính đƣợc loại bỏ bằng cách ly tâm hỗn hợp với vận tốc 13.000 vòng/phút trong 10 phút,ở 4°C. Dịch nổi sau khi ly t m đƣợc đƣa lên cột tinh sạch plasmid và ly tâm
10.000 vòng/phút trong 1 phút. Plasmid đƣợc giữ lại trên lớp màng silica còn dịch qua cột đƣợc gạn bỏ. 500 µl đệm rửa Wash uffer đƣợc bổ sung vào cột; cột đƣợc ly tâm 30 – 60 giây; dịch qua cột đƣợc gạn bỏ. Bƣớc này đƣợc lặp lại một lần nữa. 50 µl đệm đẩy Elution uffer đƣợc bổ sung vào chính giữa màng silica; cột đƣợc ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút. Plasmid đƣợc thu bằng cách ly tâm ống với vận tốc 10.000 vòng/phút trong 1 phút. Mẫu DNA plasmid tinh sạch đƣợc bảo quản ở -20°C.
2.2.2.2. Tách chiết RNA từ mô thực vật
RNA tổng số đƣợc tách chiết từ lá lúa non theo quy trình hƣớng dẫn của hãng Invitrogen. Mẫu thực vật tƣơi đƣợc thu và bảo quản trong N2 lỏng cho tới khi tách chiết. 100 mg mẫu mô thực vật đƣợc nghiền thành bột mịn trong N2 lỏng và chuyển vào ống eppendorf 1,5 ml. Sau đó, 1 ml Trizol đƣợc bổ sung vào ống; ống đƣợc đảo đều và ủ trên đá trong 5 phút. Tiếp theo, 200 µl chloroform đƣợc bổ sung vào hỗn hợp; ống đƣợc ủ trên đá trong 15 phút. Hỗn hợp đƣợc ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong 5 phút, ở 4oC. Dịch nổi đƣợc chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới 500 µl isopropanol đƣợc bổ sung vào dung dịch; ống đƣợc ủ trên đá trong 15 phút. Kết tủa RNA đƣợc thu lại bằng cách ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút, trong 15 phút, ở 4oC và đƣợc rửa lại trong 1 ml ethanol 70%. Ống đƣợc lắc mạnh trong 15 gi y, sau đó đƣợc ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 10 phút, ở 4oC. Kết tủa đƣợc thu lại và làm khô trong 1 giờ. Kết tủa RNA cuối cùng đƣợc hịa tan lại trong 50 µl dung dịch DEPC 0,2% và bảo quản ở nhiệt độ -80o
C.
2.2.2.3. Điện di DNA/RNA trên gel agarose
DNA/RNA trong mẫu thí nghiệm đƣợc phát hiện và định lƣợng tƣơng đối bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose và nhuộm Ethidium bromide (EtBr) theo phƣơng pháp của Sambrook và Russel [119].
Điện di DNA: 1,0 g agarose đƣợc đun nóng trong 100 ml đệm TAE và đúc
vào khn. Sau khi gel đơng hồn tồn, hỗn hợp mẫu gồm 5 l mẫu DNA đƣợc trộn với 1 l đệm mẫu có chứa chất chỉ thị màu là bromophenol xanh, xylene
cyanol và EtBr ở nồng độ 50 g/l đƣợc tra vào các giếng trên bản gel. Mẫu đƣợc điện di với hiệu điện thế 10 V/cm gel đến khi vạch màu chỉ thị (bromophenol xanh) cách mép gel 2 cm thì dừng lại. Sau đó, gel đƣợc lấy ra và soi dƣới ánh sáng tử ngoại, các ăng DNA gắn với EtBr xuất hiện dƣới dạng các ăng màu sáng trên nền gel đen.
Điện di RNA: 1,8 g agarose đƣợc đun nóng để hịa tan trong 170 đệm TAE,
sau đó làm mát về 65oC. 10 ml formaldehyde 37% và 20 ml đệm MOPS 10X đƣợc bổ sung vào dung dịch; hỗn hợp đƣợc lắc đều và đổ vào khuôn đúc gel. Sau khi gel đƣợc chuẩn bị, 10 µl RNA đƣợc trộn với 20 µl đệm mẫu RNA (có chứa formamide, formaldehyde, EtBr); hỗn hợp mẫu đƣợc ủ ở 65oC trong 5 phút vàlàm mát trên đá. Trƣớc khi tra mẫu điện di, gel đƣợc điện di khởi động ở hiệu điện thế 5 V/cm trong 5 phút. Mẫu đƣợc trộn với 2 µl đệm có chứa chất màu chỉ thị romophenol xanh, sau đó đƣợc tra vào giếng và điện di với hiệu điện thế 100 V trong 10 phút và 65 V trong 90 phút. Sau đó, gel đƣợc lấy ra và soi dƣới ánh sáng tử ngoại của máy soi gel, các ăng gắn với EtBr xuất hiện dƣới dạng các ăng màu sáng trên nền gel màu đen.
2.2.2.4. Đánh giá mức đ biểu hiện gen bằng kỹ thuật RT-PCR
Phản ứng tổng hợp cDNA đƣợc thực hiện theo quy trình của hãng Stratagene, sử dụng các mẫu RNA tinh sạch đã đƣợc bảo quản ở -80oC. 2,5 µg mẫu RNA tinh sạch đƣợc trộn với 0,8 µl dNTP (100 mM), 1 µl oligo dT (nồng độ 0,5 µg/µl , 2 µl đệm 10X trong ống PCR thể tích 200 µl. H2O khử RNase đƣợc bổ sung vào hỗn hợp để đạt tổng thể tích là 16,5 µl. Hỗn hợp đƣợc ủ ở 65oC trong 5 phút, sau đó đƣợc làm mát và để ở nhiệt độ phịng trong 5 phút. 0,5 µl chất ức chế RNase, 2 µl DDT 100 mM và 1 µl Reverse Transcriptase đƣợc thêm vào trong ống phản ứng. Ống đƣợc ủ ở 42oC trong 60 phút để phản ứng tổng hợp cDNA xảy ra. Sản phẩm phản ứng đƣợc bảo quản ở nhiệt độ -80oC.
Mẫu cDNA đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng RT-PCR với cặp mồi NAC1-RT-Fw/NAC1-RT-Rv (Bảng 2.1). Thành phần của phản ứng bao gồm: 0,5 µl mẫu DNA khn; 0,6 µl mỗi loại mồi; 1,5 µl đệm Taq DNA polymerase 10 X;
1,5 µl dNTPs 2 mM; 0,5 µl TaqDNA polymerase; 9,8 µl H2O cất khử trùng khử ion. Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với chu trình nhiệt: 94oC-5 phút; (94oC – 30 giây, 56oC – 20 giây, 72oC - 40 giây) x 35 chu kỳ; 72oC - 7 phút và bảo quản ở 4oC. Sản phẩm phản ứng PCR đƣợc điện di trên gel agarose 1%. Mức độ biểu hiện gen tƣơng quan giữa các dòng cây chuyển gen đƣợc phân tích bằng phần mềm ImageJ. Gen
Actin đƣợc sử dụng làm gen nội chuẩn.
2.2.2.5. Xác định tương đối số lượng ản cop ằng kỹ thuật qRT-PCR
DNA tổng số (10 ng/µl) của c y lúa chuyển gen thu đƣợc theo quy trình miêu tả trong mục 2.2.2.1 đƣợc sử dụng trực tiếp làm khuôn cho qRT-PCR. Phản ứng qRT-PCR đƣợc tiến hành với mồi đặc hiệu cho gen Hygromycin Hyg-RT-Fw/ Hyg-RT-Rv (Bảng 2.1)và 1 gen đối chứng chƣa công ố-đang xin ản quyền . Thành phần của phản ứng bao gồm: 7,5 µl MESA Blue ao gồm Hotstart Meteor
Taq, dNTPs, MgCl2, SYBR, chất nội chuẩn ROX và chất chỉ thị màu xanh dƣơng ,
0,4 µl mỗi loại mồi (10 pmol/µl); 1 µl khn (DNA và 5,3 µl H2O. Phản ứng đƣợc thực hiện trên hệ thống máy Mx3005P (Stratagene, Mỹ). Chu trình nhiệt của phản ứng qRT-PCRnhƣ sau: 10 phút - 95o
C; (95oC - 15 giây, 60oC - 30 giây, 72oC - 30 giây) x 40 chu kì; 72oC - 10 phút; mẫu bảo quản ở 4oC.
Số lƣợng ản sao của gen chuyển đƣợc tính tốn ằng cách so sánh giá trị Ct theo công thức quy đổi của Zhang và cộng sự [159]:
Số bản sao gen chuyển NC = 2ΔCt
(trong đó ΔCt = CtHygromycin – Ctđối chứng).
Ở thế hệ T0, giá trị NC = 2ΔCt dao động từ 0,38 đến 0,67 tƣơng ứng với việc các c y chỉ có 1 bản sao gen chuyển.
Từ thế hệ T1 trở đi, giá trị NC cho ph p xác định thể đồng hợp và dị hợp tử của cây chuyển gen mang 1 bản sao. Giá trị NC dao động trong khoảng từ 0,38 đến 0,67 sẽ có kiểu hình là dị hợp tử gen chuyển, từ 0,9 đến 1,02 tƣơng ứng với kiểu hình đồng hợp tử gen chuyển.
2.2.3. Nhân dòng gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 vào vector pGEM-T
Đoạn gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 đƣợc nhân bản từ cDNA (cDNA đƣợc tổng hợp theo quy trình của hãng Stratagene, sử dụng mẫu RNA tinh sạch là hỗn hợp các mẫu RNA của lúa Tẻ đỏ xử lý hạn tại các thời điểm khác nhau trộn lẫn vào nhau) bằng kỹ thuật PCR [119], sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho từng gen OsNAC1-Fw/OsNAC1-Rv (cho OsNAC1), OsNAC5-Fw/OsNAC5-Rv (cho OsNAC5) và OsNAC10-Fw/OsNAC10-Rv (choOsNAC10) (Bảng 2.1). Hỗn hợp
phản ứng bao gồm: 0,5 µl cDNA khn; 1 µl mỗi loại mồi; 2,5 µl đệm Taq
polymerase 10X; 2,5 µl dNTP 2 mM; 1 µl Taq polymerase; 17,5 µl H2O cất khử trùng khử ion. Phản ứng đƣợc thực hiện 35 chu kỳ: biến tính DNA ở 95oC – 30 giây, gắn mồi ở 55oC – 30 giây và kéo dài chuỗi ở 72oC – 1 phút. Sản phẩm PCR sau đó đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% theo quy trình đã trình ày ở trên.
Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch từ gel agarose bằng bộ kit GenJETTM Gel Extraction (Thermo Scientifics theo quy trình hƣớng dẫn. Băng DNA quan t m đƣợc
cắt chính xác từ gel agarose và đƣa vào ống eppendorf 1,5 ml. Đệm bám (Binding uffer đƣợc bổ sung vào ống 1 µl đệm ~ 1 mg gel); ống đƣợc ủ ở 60°C trong khoảng 10 phút đến khi gel tan hoàn toàn. Dung dịch gel agarose đã hòa tan đƣợc chuyển lên cột tinh sạch và ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 1 phút. Sau đó phần dịch đi qua màng đƣợc gạn bỏ. Tiếp theo, 500 µl đệm rửa (Wash uffer đƣợc bổ sung vào cột và ly tâm trong 1 phút ở vận tốc 10.000 vòng/phút. Phần dịch đi qua màng đƣợc gạn bỏ. Bƣớc rửa cột đƣợc lặp lại một lần nữa.100 µl đệm đẩy (Elution buffer đƣợc bổ sung vào chính giữa lớp màng silica của cột. DNA đƣợc thu bằng cách ly tâm cột trong 1 phút ở tốc độ 10.000 vòng/phút. Mẫu DNA tinh sạch đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose (mục 2.2.2.3) và đƣợc bảo quản ở -20°C.
Sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 đƣợc nhân dòng vào vector pGEM-T theo quy trình hƣớng dẫn đi kèm ộ kit (Promega). Hỗn hợp phản ứng bao gồm: 1 µl sản phẩm PCR tinh sạch, 1 µl vector pGEM-T
mạch thẳng 50 ng , 5 µl đệm 2X, 1 µl T4 DNA Ligase (3 U/µl) và 2 µl H2O cất khử trùng, khử ion. Hỗn hợp phản ứng ghép nối DNA đƣợc ủ ở 4oC qua đêm.
Sản phẩm phản ứng ghép nối đoạn gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 vào vector pGEM-T đƣợc biến nạp vào vi khuẩn E. coli DH5α khả biến. Tế bào E.coli DH5α khả biến (bảo quản trong tủ lạnh sâu -80°C đƣợc làm tan trên đá trong 10 phút. Tiếp đó, hỗn hợp phản ứng ghép nối đƣợc bổ sung vào dung dịch tế ào đã rã đông và đƣợc ủ trên đá trong 20 phút để tạo điều kiện cho DNA bám vào thành tế bào. Tế ào đƣợc sốc nhiệt bằng cách chuyển sang bể ổn nhiệt 42°C trong 45 giây, sau đó đƣợc chuyển lại ủ trên đá trong 2 phút. Tiếp theo, 450 µl LB lỏng đƣợc bổ