Ghi chú: Sản phẩm PCR nhân bản gen đích từ các mẫu cDNA c a lúa Tẻ đỏ được điện di
trên gel agarose 1%. (A) PCR nhân bản gen OsNAC1, giếng 1: mẫu lúa xử lý hạn, giếng 2: đối chứng âm (mẫu lúa không xử lý hạn); (B) PCR nhân bản gen OsNAC5, giếng 2:
khuôn là cDNA; giếng 1: đối chứng âm. (C) PCR nhân bản gen OsNAC10, giếng 2: khuôn là cDNA; giếng 1: đối chứng âm. Giếng M: thang chuẩn DNA 1kb.
Kết quả thu đƣợc chứng tỏ 3 đoạn gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 đã đƣợc nhân bản từ cDNA của lúa Tẻ Đỏ xử lý stress hạn. Ngoài ra, kết quả này cũng ƣớc đầu cho thấy 3 gen đích cảm ứng biểu hiện với điều kiện stress hạn. Sản phẩm PCR sau đó đƣợc tinh sạch để sử dụng cho thí nghiệm nhân dịng gen tiếp theo.
Nhân dịng các gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC vào vector pGEM-T
Sản phẩm nhân bản OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 đƣợc tinh sạch nhằm loại bỏ toàn bộ các thành phần dƣ thừa của phản ứng PCR, sau đó gh p nối vào vector nhân dòng pGEM-T. Các đoạn gen đích đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng Taq DNA polymerase nên sản phẩm PCR sau khi đƣợc tinh sạch là các đoạn DNA có gắn thêm gốc AMP ở đầu 3’ và dễ dàng đƣợc nhân dòng trực tiếp vào vector nhân dịng mạch thẳng có đầu T (pGEM-T).
Thể biến nạp (khuẩn lạc trắng) xuất hiện trên mơi trƣờng chọn lọc có bổ sung chất kháng sinh Ampicillin, chất cảm ứng IPTG và cơ chất X-Gal đƣợc sàng lọc bằng phƣơng pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu để kiểm tra sự có mặt gen.
Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% cho thấy, với các phản ứng sử dụng khuôn là khuẩn lạc thu đƣợc các ăng DNA có kích thƣớc ~1,0kb (Hình 3.3A, giếng 3 & 5-8), 1 kb (Hình 3.3B, giếng 1-6 & 8) và ~1,2 kb (Hình 3.3C, giếng 4-9 , tƣơng tự nhƣ kích thƣớc ăng DNA của phản ứng đối chứng dƣơng sử dụng mẫu cDNA làm khn (Hình 3.3A, giếng 2; Hình 3.3B, giếng 9; Hình 3.3C, giếng 2 . Ngƣợc lại, đối với các phản ứng đối chứng âm sử dụng khuôn là khuẩn lạc không đƣợc biến nạp, kết quả điện di không thu đƣợc ăng DNA nào Hình 3.3A, giếng 1;Hình 3.3B, giếng 10; Hình 3.3C, giếng 1). Kết quả này cho ph p ƣớc đầu kết luận đã thu nhận đƣợc các khuẩn lạc dƣơng tính mang plasmid tái tổ hợp có chứa các gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10.