Chƣơng 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THẢO LUẬN
3.3.2. Nghiên cứu chuyển gen OsNAC1 vào lúa
truyền nông nghiệp nhập nội và tuyển chọn. Giống lúa J02 có năng suất cao, chất lƣợng tốt và mở rộng gieo trồng trên nhiều tỉnh thuộc miền Bắc và miền Trung Việt Nam. Tháng 12/2013, giống lúa này đƣợc hội đồng Khoa học Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn công nhận đặc cách là giống quốc gia. Tuy nhiên, giống lúa J02 lại là có khả năng chịu hạn kém. Theo báo cáo kết quả của đề tài “Nghiên cứu chức năng gen quy định phát triển bộ rễ lúa, phục vụ công tác chọn tạo giống lúa chịu hạn bằng công nghệ gen”, TS. Mai Đức Trung và nhóm nghiên cứu cũng đã thực hiện khảo sát khả năng chịu hạn tập đoàn 185 giống lúa sử dụng phƣơng pháp thang điểm IRRI, trong đó giống lúa J02 đƣợc xác định có khả năng chịu hạn trung bình kém với thang điểm là 8 sau 2 tuần xử lý hạn. Trong nghiên cứu này, giống lúa J02 đƣợc sử dụng làm đối tƣợng tiếp nhận gen OsNAC1 nhằm hƣớng tới tạo dịng lúa vừa có năng suất, chất lƣợng tốt, đồng thời có khả năng chống chịu hạn cao.
Bảng 3.2: Kết quả chuyển gen vào lúa thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
Cấu trúc gen chuyển Tổng số mơ sẹo thí nghiệm* Mơi trƣờng chọn lọc (mơ sẹo) Môi trƣờng tái sinh chồi (mô sẹo) Môi trƣờng tái sinh rễ (mô sẹo) Lip9: OsNAC1 ~100 38 32 29 Ubi: OsNAC1 ~100 50 37 36 35S: OsNAC1 ~100 51 44 41 Rd29A: OsNAC1 ~100 38 14 14 pBI101 ~100 27 17 17 pCAMBIA1301 ~100 41 27 25 Tổng 600 245 171 162
Ghi chú: *100 mơ sẹo được sử dụng cho mỗi lơ thí nghiệm chuyển gen.
Các cấu trúc biểu hiện gen OsNAC1 đƣợc chuyển vào mô sẹo của lúa J02 (Oryza sativa L. Japonica) thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. Mô sẹo đƣợc lây
nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc biểu hiện gen OsNAC1
(Ubi:OsNAC1:Nos, Lip9:OsNAC1:Nos, 35S:OsNAC1:Nos, Rd29A:OsNAC1:Nos) và cấu trúc vector nhị phân không biểu hiện gen OsNAC1 (pCAMBIA1301, pBI101).
Qua đó, cấu trúc T-DNA chứa cấu trúc biểu hiện gen chọn lọc kháng chất kháng sinh Hygromycin đƣợc chuyển vào mô sẹo, vì vậy các mơ sẹo đã đƣợc sàng lọc trên mơi trƣờng ni cấy có chứa Hygromycin để chọn ra các dịng tế bào tái tổ hợp có mang cấu trúc biểu hiện gen chuyển. Kết quả nuôi cấy trên mơi trƣờng chọn lọc có bổ sung Hygromycin 50 mg/l cho thấy, từ 600 mô sẹo đã thu đƣợc 245 mơ sẹo sống sót (40,3%). Mơ sẹo sống sót và phát triển qua 2 lần chọn lọc trên môi trƣờng ni cấy có chất kháng sinh có thể là những mơ sẹo chứa các tế bào tái tổ hợp mang cấu trúc gen chuyển trong hệ gen. Tất cả các mô sẹo này đƣợc chuyển sang nuôi cấy trên môi trƣờng tái sinh chồi và rễ để tạo thành cây lúa hoàn chỉnh. Kết quả tái sinh chồi và rễ cho thấy, từ 245 mô sẹo sống sót thu đƣợc 162 cây tái sinh hồn chỉnh (66,12%) (Hình 3.16, Bảng 3.2).
Trƣớc đ y, phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
không đƣợc xem là có hiệu quả với cây một lá mầm. Tuy nhiên, hiện nay, phƣơng pháp iến nạp gen vào lúa nhờ vi khuẩn A. tumefaciens là phƣơng pháp
đƣợc lựa chọn sử dụng hơn cả, do số bản sao của gen biến nạp đƣợc chèn vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ thấp, bền vững [61]. Đặc biệt, phƣơng pháp này cho hiệu quả chuyển gen cao, khả năng chuyển đƣợc đoạn ADN có kích thƣớc lớn và chi phí thấp. Một trong những cơng trình nghiên cứu đánh dấu ƣớc tiến bộ quan trọng trong kỹ thuật chuyển gen lúa sử dụng A. tumefaciens là cơng
trình của Hiei và cộng sự (1994). Nhóm nghiên cứu này đã x y dựng đƣợc quy trình chuyển gen hiệu quả cho một số giống lúa nhóm Japonica nhƣ Tsukinohikari, Asanohikari và Koshihikari [61]. Từ đó, kỹ thuật này đƣợc áp dụng rộng rãi và cải tiến ở nhiều phịng thí nghiệm trên thế giới. Tại Việt Nam, giống lúa J02 đã và đang là đối tƣợng nghiên cứu khảo sát đánh giá khả năng tạo
callus, tái sinh và chuyển gen dựa trên quy trình của Hiei và cs (1994) [1, 5]. Trong nghiên cứu này, cấu trúc biểu hiện gen OsNAC1 đƣợc chuyển vào giống
J02 theo quy trình cải tiến của Hiei và cộng sự, kết quả từ 600 callus chuyển gen thu đƣợc 162 cây tái sinh hoàn chỉnh, hiệu suất chung của quá trình tái sinh, từ callus tới tái sinh thành cây hồn chỉnh đạt trung bình là 27%.
Hình 3.16: Chuyển cấu trúc biểu hiện gen OsNAC1 vào lúa
Ghi chú: (A) Mô sẹo hình thành từ phơi trưởng thành trên mơi trường cảm ứng mô sẹo
NB-IND tạo mô sẹo. (B) Mô sẹo và vi khuẩn A.tumefacien LBA4404 mang OsNAC1 trên môi trường đồng nuôi cấy R2-CS. (C) Mô sẹo trên môi trường chọn lọc 1 R2-S. (D) Mô sẹo trên môi trường tái sinh RN. (E) Chồi lúa non trên môi trường tạo rễ R. (F) và (K)Cây lúa tái sinh hoàn chỉnh đưa ra chậu.
3.3.3. Sàng lọc các dòng lúa tái sinh đƣ c chuyển cấu trúc biểu hiện OsNAC1
3.3.3.1. Xác định cây lúa tái sinh mang cấu trúc biểu hiện OsNAC1
Các cây tái sinh đƣợc sàng lọc bằng kỹ thuật PCR để xác định sự có mặt của cấu trúc biểu hiện gen đích trong hệ gen. Mẫu DNA tách chiết từ mô lá của cây lúa tái sinh đƣợc sử dụng làm khuôn trong phản ứng PCR với lần lƣợt các cặp mồi đặc hiệu Actin-Fw/Actin-Rv (kiểm tra chất lƣợng DNA tách chiết thông qua gen nội chuẩn Actin), Hyg-Fw/ Hyg-Rv (kiểm tra sự có mặt của gen chọn lọc kháng Hygromycin) và OsNAC1-t-Fw/NosT-Rv (kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện gen đích OsNAC1:Nos). Các cây tái sinh có kết quả PCR dƣơng tính với cả 3 cặp mồi đƣợc xác định là cây mang cấu trúc biểu hiện gen đích. Kết quả, từ 162 cây lúa tái sinh đã thu đƣợc 93 cây tái sinh mang cấu trúc biểu hiện gen đích, trong đó có 21 cây tái sinh mang cấu trúc Lip9:OsNAC1:Nos, 30 c y tái sinh mang cấu trúc
Ubi:OsNAC1:Nos, 31 cây tái sinh mang cấu trúc 35S:OsNAC1:Nos và 11 cây tái sinh mang cấu trúc Rd29A: OsNAC1:Nos (Bảng 3.3).
Bảng 3.3: Kết quả sàng lọc cây lúa tái sinh đƣ c chuyển gen OsNAC1 Cấu trúc gen
chuyển
Số cây kiểm tra
Số cây có kết quả PCR dƣơng tính
Actin Hygromycin OsNAC1:Nos
Lip9:OsNAC1 29 29/29 21/29 21/29 Ubi:OsNAC1 36 36/36 30/36 30/36 35S:OsNAC1 41 41/41 31/41 31/41 Rd29A:OsNAC1 14 14/14 11/14 11/14 pBI101 17 17/17 13/17 0/0 pCAMBIA1301 25 25/25 18/25 0/0 Tổng 162 162/162 124/162 93/162
Ghi chú: Cây lúa tái sinh sàng lọc bằng kỹ thuật PCR với ba cặp mồi Actin-Fw/Actin-Rv,
Hyg-Fw/ Hyg-Rv và OsNAC1-t-Fw/NosT-Rv.
đƣợc các cây lúa tái sinh có mang cấu trúc biểu hiện gen đích OsNAC1 trong hệ gen (cây lúa chuyển gen T0). Các cây lúa mang cấu trúc biểu hiện gen đích đƣợc tiếp tục xác định số lƣợng bản sao cấu trúc gen chuyển bằng kỹ thuật qRT-PCR.
3.3.3.2. Xác định cây lúa chuyển gen T0 mang m t bản sao cấu trúc biểu hiện OsNAC1
Trong quá trình chuyển gen, đoạn DNA mới đƣợc chèn ngẫu nhiên vào hệ gen của cây chủ, với một bản sao hay nhiều bản sao trên cùng một NST hoặc trên nhiều NST khác nhau. Số lƣợng nhiều bản sao của gen ngoại sinh chèn vào hệ gen vật chủ là nguyên nhân khiến cho gen chuyển không hoạt động hoặc biểu hiện không ổn định, đồng thời g y khó khăn cho việc kiểm soát quá trình di truyền của các gen chuyển qua các thế hệ. Thông thƣờng, cây chủ mang 1 bản sao của gen chuyển thƣờng có mức biểu hiện của gen chuyển cao và ổn định. Chính vì vậy, ƣớc thiết yếu đầu tiên khi thu nhận đƣợc cây chuyển gen là xác định số lƣợng bản sao gen chuyển [80, 98, 143]. Phƣơng pháp ph n tích PCR định lƣợng thời gian thực - Quantitative Real Time PCR (qRT-PCR) là phƣơng pháp thông thƣờng để xác định số lƣợng bản sao gen chuyển. Phƣơng pháp qRT- PCR đã đƣợc sử dụng phổ biến để xác định số lƣợng bản sao và thể đồng hợp tử gen chuyển trong cây chuyển gen nhƣ lúa mì [50, 84], ngơ [128, 158], lúa [154], cà chua [54] và mía [32]. Trong thí nghiệm này, các cây có kết quả PCR dƣơng tính với các cặp mồi đặc hiệu đƣợc tiến hành xác định số lƣợng bản sao gen chuyển OsNAC1 thông qua định lƣợng gen chọn lọc Hygromycin ằng qPCR. Hàm lƣợng DNA gen chuyển đƣợc xác định gián tiếp thông qua so sánh với hàm lƣợng DNA gen đối chứng tồn tại đơn ản trong hệ gen lúa chƣa đƣợc công bố - đang xin ản quyền). Về nguyên tắc, cả hai cặp mồi thiết kế cho Hygromycin và gen đối chứng đều cho hiệu suất nhân bản tƣơng đƣơng nhau và gần bằng 1 (1,002 và 1,003), ngoài ra, mức độ liên hệ tuyến tính phải chặt chẽ (Phụ lục 11). Kết quả khảo sát cho thấy, gen Hygromycin với cặp mồi thiết kế đáp ứng đƣợc
các nguyên tắc của thí nghiệm qRT-PCR. Kết quả ph n tích định lƣợng gen Hygromycin bằng qRT-PCR thu đƣợc hệ số quy đổi 2ΔCt từ 0,4 – 1,12, trong đó 52 dịng lúa có 2ΔCt từ 0,4 – 0,67 tƣơng ứng với 1 bản sao và 72 dịng có 2ΔCt từ 0,92 – 1,12 tƣơng ứng với hơn 1 ản sao (Bảng 3.4, Phụ lục 13, Phụ lục 14). Các dòng lúa mang một bản sao gen chuyển đƣợc tiếp tục phân tích trong các thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 3.4: Kết quả xác định số lƣ ng bản sao gen kháng Hygromycin trong cây lúa chuyển gen T0
Cấu trúc gen
chuyển Số cây kiểm tra
qRT-PCR 1 bản sao > 1 bản sao Lip9: OsNAC1 21 12/21 9/29 Ubi: OsNAC1 30 16/30 14/30 35S: OsNAC1 31 11/31 20/31 Rd29A: OsNAC1 11 3/11 8/11 pBI101 13 4/13 9/13 pCAMBIA1301 18 6/18 12/18 Tổng 124 52/124 72/124
Ghi chú: qRT-PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu gen Hygromycin (Hyg-RT-Fw/Hyg-RT-Rv) 3.3.3.3. Sự sinh trưởng của các cây lúa chuyển gen T0 trong nhà lưới
Các cây lúa mang một bản sao gen chuyển đƣợc tiếp tục chuyển sang trồng trong chậu trong điều kiện nhà lƣới. Kết quả sinh trƣởng của các cây lúa chuyển gen T0 trong Bảng 3.5 cho thấy có 39/52 cây lúa chuyển gen T0 có khả năng sinh trƣởng và phát triển ình thƣờng trong điều kiện nhà lƣới; các cây còn lại chết trong các giai đoạn khác nhau. Tuy nhiên, d sinh trƣởng ình thƣờng và khơng có sự khác biệt so với c y đối chứng không chuyển gen, nhiều cây lúa chuyển gen không thể trổ ơng và kết hạt ình thƣờng (50% số cây), 18 cây lúa chuyển gen có khả năng kết hạt ình thƣờng, trong đó có 5 cây lúa mang cấu trúc Lip9:OsNAC1:Nos; 8 cây lúa mang cấu trúc Ubi:OsNAC1:Nos; 1 cây lúa mang cấu trúc 35S:OsNAC1:Nos, 1
pCAMBIA1301. Tuy nhiên, số lƣợng hạt thu đƣợc (hạt T0) ở cây lúa chuyển cấu trúc 35S:OsNAC1:Nos và cây lúa chuyển cấu trúc Rd29A:OsNAC1:Nos quá ít nên
chỉ 13 cây lúa chuyển gen T0, bao gồm 5 cây lúa chuyển cấu trúc
Lip9:OsNAC1:Nos (ký hiệu là L1, L2, L3, L4, L5) và 8 cây lúa chuyển cấu trúc Ubi:OsNAC1:Nos (ký hiệu là U1, U2, U3, U4, U5, U6, U7, U8) đƣợc sử dụng cho
thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 3.5: Kết quả sinh trƣởng của cây lúa chuyển gen T0 trong nh lƣới
Giai đoạn
Cấu trúc chuyển gen
Tổng Lip9: OsNAC1 Ubi: OsNAC1 35S: OsNAC1 Rd29A:
OsNAC1 pBI101 pCAM1301
Tái sinh in vitro 12 16 11 3 4 6 52 Sinh trƣởng 11 14 6 2 1 5 39 Trổ ông 8 11 3 1 1 3 27 Kết hạt 6 8 2 1 0 3 20 Thu hạt T0 5 8 1 1 0 3 18
3.3.4. Chọn lọc dòng lúa chuyển gen T1
Để phục vụ cho thí nghiệm phân tích đánh giá sinh trƣởng phát triển và khả năng chịu hạn cũng nhƣ mức độ biểu hiện gen đích trong các dòng lúa chuyển gen, các cây lúa T1 đƣợc sàng lọc để chọn ra các dịng có mang gen đích ở dạng đồng hợp tử.
Hạt của các dòng lúa T0 (cây T1 đƣợc sàng lọc trên môi trƣờng ổ sung Hygromycin để loại ỏ các cây T1 không mang cấu trúc chuyển gen. Kết quả, từ 95 hạt của cây lúa T0 (của 13 cây T0) có 62 hạt nảy mầm trên mơi trƣờng có bổ sung hygromycin (Bảng 3.6). Sự xuất hiện hạt của cây T0 khơng có khả năng nảy mầm trên mơi trƣờng chứa Hygromycin có thể do hai ngun nhân chính: (i) sự ph n ly độc lập và tổ hợp tự do theo định luật Menđen c y lúa chuyển gen T0 đƣợc cho tự thụ phấn hồn tồn), (ii) vị trí và số lƣợng bản sao của cấu trúc biểu hiện
gen trong hệ gen cây chủ ảnh hƣởng tới khả năng iểu hiện của gen chuyển. Các cây lúa kháng Hygromycin sau đó đƣợc chuyển sang trồng trong điều kiện mơi trƣờng ình thƣờng để tiếp tục ph n tích đặc điểm kiểu gen.
Bảng 3.6: Kết quả sàng lọc các dòng lúa chuyển gen T1
Dòng lúa chuyển gen T1 Số hạt kiểm tra Số hạt nảy mầm trên môi trƣờng bổ sung Hygromycin
Số cây có kết quả PCR dƣơng tính Số cây đồng h p
tử (> 1 bản sao)
Actin Hygromycin OsNAC1:Nos
Lip9: OsNAC1 L1 5 3 3/3 3/3 3/3 1/3 L2 12 9 9/9 9/9 9/9 2/9 L3 6 2 2/2 2/2 2/2 0/2 L4 18 12 12/12 11/12 11/12 2/11 L5 7 4 4/4 3/4 3/4 1/3 U1 2 0 0/0 0/0 0/0 0/0 Ubi: OsNAC1 U2 7 5 5/5 5/5 5/5 1/5 U3 4 3 3/3 3/3 3/3 0/3 U4 15 12 12/12 11/12 11/12 3/11 U5 5 4 4/4 4/4 4/4 1/4 U6 10 7 7/7 7/7 7/7 2/7 U7 2 1 1/1 0/1 0/1 0/1 U8 2 0 0/0 0/0 0/0 0/0 Tổng cộng 95 62/95 62/62 58/62 58/62 13/58
Ghi chú: L1- L5: các dòng lúa chuyển cấu trúc Lip9:OsNAC1:Nos. U1 - U8: các dòng lúa
chuyển cấu trúc Ubi:OsNAC1:Nos.
Các hạt nảy mầm đƣợc đem gieo trồng và kiểm tra khả năng mang cấu trúc biểu hiện gen đích ằng kỹ thuật PCR. Kết quả, 58 cây đƣợc xác định có mang cấu trúc biểu hiện gen đích có kết quả PCR dƣơng tính với cả hai cặp mồi đặc hiệu cho
gen Hygromycin và cấu trúc OsNAC1:Nos). Trong số 58 cây mang cấu trúc biểu
hiện gen đích, 45 cây mang gen chuyển ở trạng thái dị hợp tử (1 bản sao gen chuyển) và 13 cây mang gen chuyển ở trạng thái đồng hợp tử (2 bản sao của gen chuyển) (Bảng 3.6, Phụ lục 15 - 16).
Các c y T1 đồng hợp tử (13 cây) tiếp tục đƣợc trồng trong điều kiện nhà lƣới để thu hạt. Khi sinh trƣởng phát triển trong nhà lƣới, 11 c y sinh trƣởng bình thƣờng và cho hạt T1. Hai cây không kết hạt (cây chuyển mang cấu trúc
Ubi:OsNAC1:Nos) (Bảng 3.7). Hạt T1 của 11 cây lúa chuyển gen đã đƣợc thu lại để tiếp tục đƣợc sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo. Các c y này đƣợc ký hiệu lần lƣợt là L1.1, L2.1, L2.2, L4.1, L4.2, L5.1, U2.1, U4.1, U4.2, U5.1, U6.1.
Bảng 3.7: Kết quả sinh trƣởng của các cây lúa chuyển gen đời T1
Giai đoạn Số cây lúa chuyển gen T1
Lip9: OsNAC1 Ubi: OsNAC1
Số c y 6 7
Sinh trƣởng trong nhà lƣới 6 7
Trổ ông 6 5 Kết hạt 6 5 Thu hạt T1 6 ký hiệu: L1.1, L2.1, L2.2, L4.1, L4.2, L5.1) 5
ký hiệu: U2.1, U4.1, U4.2, U5.1, U6.1)
3.3.5. Chọn lọc dòng lúa chuyển gen T2
Hạt của các dòng lúa chuyển gen T1 (L1.1, L2.1, L2.2, L4.1, L4.2, L5.1, U2.1, U4.1, U4.2, U5.1, U6.1) (cây T2) đƣợc gieo trên môi trƣờng MS có bổ sung kháng sinh chọn lọc Hygromycin. Những cây phát triển từ hạt nảy mầm trên môi trƣờng kháng sinh chọn lọc tiếp tục đƣợc kiểm tra mang cấu trúc gen chuyển bằng các cặp mồi đặc hiệu cho gen Actin, Hygromycin và cấu trúc OsNAC1:Nos. Những cây cho kết quả dƣơng tính với cả ba cặp mồi đƣợc sử dụng trong thí nghiệm xác
định mức độ biểu hiện của gen chuyển OsNAC1.
Mặc d đã xác định đƣợc sự có mặt của cấu trúc Ubi:OsNAC1 và
Lip9:OsNAC1 trong cây lúa chuyển gen T2, sự biểu hiện của OsNAC1 còn phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố nhƣ vị trí của cấu trúc biểu hiện gen trong hệ gen, sự tƣơng tác với các yếu tố điều hòa trong nhân... [24]. Trong nghiên cứu này, mức độ biểu hiện gen chuyển OsNAC1 trong các dòng lúa chuyển gen đƣợc xác định thơng qua hàm lƣợng mRNA OsNAC1 tích luỹ trong mô bằng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu OsNAC1-RT-Fw/OsNAC1-RT- Rv. RNA tổng số tách chiết từ lá các cây lúa T2 ở giai