Giai đoạn Số cây lúa chuyển gen T1
Lip9: OsNAC1 Ubi: OsNAC1
Số c y 6 7
Sinh trƣởng trong nhà lƣới 6 7
Trổ ông 6 5 Kết hạt 6 5 Thu hạt T1 6 ký hiệu: L1.1, L2.1, L2.2, L4.1, L4.2, L5.1) 5
ký hiệu: U2.1, U4.1, U4.2, U5.1, U6.1)
3.3.5. Chọn lọc dòng lúa chuyển gen T2
Hạt của các dòng lúa chuyển gen T1 (L1.1, L2.1, L2.2, L4.1, L4.2, L5.1, U2.1, U4.1, U4.2, U5.1, U6.1) (cây T2) đƣợc gieo trên môi trƣờng MS có bổ sung kháng sinh chọn lọc Hygromycin. Những cây phát triển từ hạt nảy mầm trên môi trƣờng kháng sinh chọn lọc tiếp tục đƣợc kiểm tra mang cấu trúc gen chuyển bằng các cặp mồi đặc hiệu cho gen Actin, Hygromycin và cấu trúc OsNAC1:Nos. Những cây cho kết quả dƣơng tính với cả ba cặp mồi đƣợc sử dụng trong thí nghiệm xác
định mức độ biểu hiện của gen chuyển OsNAC1.
Mặc d đã xác định đƣợc sự có mặt của cấu trúc Ubi:OsNAC1 và
Lip9:OsNAC1 trong cây lúa chuyển gen T2, sự biểu hiện của OsNAC1 còn phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố nhƣ vị trí của cấu trúc biểu hiện gen trong hệ gen, sự tƣơng tác với các yếu tố điều hòa trong nhân... [24]. Trong nghiên cứu này, mức độ biểu hiện gen chuyển OsNAC1 trong các dòng lúa chuyển gen đƣợc xác định thơng qua hàm lƣợng mRNA OsNAC1 tích luỹ trong mô bằng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu OsNAC1-RT-Fw/OsNAC1-RT- Rv. RNA tổng số tách chiết từ lá các cây lúa T2 ở giai đoạn 3 lá non kháng Hygromycin và có kết quả kiểm tra PCR dƣơng tính (với 3 cặp mồi đặc hiệu cho gen Actin, Hygromycin và cấu trúc biểu hiện gen đích OsNAC1) đƣợc sử dụng làm khuôn cho các phản ứng RT-PCR. Mẫu RNA tổng số tách chiết từ cây lúa không chuyển gen đƣợc sử dụng làm mẫu đối chứng âm; gen Actin đƣợc sử dụng làm gen nội chuẩn. Mức độ biểu hiện của gen OsNAC1 trong cây chuyển gen đƣợc xác định tƣơng đối thông qua việc so sánh hàm lƣợng mRNA của cây lúa chuyển gen với c y lúa đối chứng không chuyển gen chỉ mang gen nội sinh.
Kết quả phân tích biểu hiện gen bằng RT-PCR cho thấy cả 5 dòng lúa chuyển cấu trúc Ubi:OsNAC1:Nos đƣợc kiểm tra có biểu hiện gen đích. Sử dụng
phần mềm ImageJ, mức độ biểu hiện gen OsNAC1 tƣơng quan giữa các dòng lúa
chuyển gen đã đƣợc xác định (Hình 3.17B). Kết quả so sánh cho thấy, gen đích
OsNAC1 đã iểu hiện ở tất cả 5 dòng lúa chuyển gen đƣợc kiểm tra, thể hiện ở hàm
lƣợng mRNA OsNAC1 trong cây chuyển gen cao hơn rõ rệt so với c y lúa đối
chứng không chuyển gen (cao gấp ~20 đến 40 lần so với c y lúa đối chứng). Mức độ biểu hiện của gen đích OsNAC1 giữa các dịng lúa chuyển gen có sự khác biệt. Cụ thể, hàm lƣợng mRNA OsNAC1 cao nhất đƣợc phát hiện ở dòng U3.1 và U5.1 (cao gấp 40 lần so với dòng đối chứng); 3 dòng U2.1, U4.2 và U6.1 có mức độ biểu hiện gen đích ở mức thấp hơn cao gấp 20 – 25 lần so với dịng đối chứng). (Hình 3.17B).
Hình 3.17: Biểu hiện của OsNAC1 trong các dòng lúa chuyển gen Ubi:OsNAC1
Ghi chú: Mức độ biểu hiện c a gen chuyển trong các dòng lúa chuyển gen T2 (U2.1, U3.1,
U4.2, U5.1 và U6.1) được so sánh với dịng lúa khơng chuyển gen (ĐC) thơng qua bán định lượng mRNA bằng kĩ thuật RT-PCR với cặp mồi OsNAC1-RT-Fw/OsNAC1-RT- Rv.
(A) Sản phẩm RT-PCR được điện di trên gel agarose 1%. Giếng(-): đối chứng âm (khơng
có DNA khn); giếng +: đối chứng dương (khuôn là pBI-Ubi/OsNAC1); giếng ĐC: khuôn là mẫu RNA tách chiết từ cây lúa không chuyển gen. (B) Đồ thị so sánh hàm lượng mRNA OsNAC1 tương quan giữa các dòng lúa. Mức độ biểu hiện c a OsNAC1 trong cây lúa khơng chuyển gen có giá trị bằng 1. Gen actin được sử dụng làm gen nội chuẩn.
Tƣơng tự, kết quả xác định mức độ biểu hiện gen OsNAC1 dƣới sự điều khiển biểu hiện của promoter hoạt động cảm ứng Lip9 cũng cho thấy gen đích đã iểu hiện ở tất cả 6 dòng lúa chuyển gen đƣợc kiểm tra và biểu hiện cao hơn rõ rệt so với c y đối chứng (gấp 10 – 30 lần). Tuy nhiên, mức độ biểu hiện của gen chuyển giữa các dòng lúa chuyển gen cũng có sự khác biệt tƣơng đối lớn. Trong đó, dịng L1.1 có mức độ
biểu hiện cao nhất, gấp 30 lần so với c y đối chứng; 3 dịng L1.1, L4.1 và L4.2 biểu hiện gen đích ở mức độ gấp ≥ 20 lần so với c y đối chứng; 2 dòng lúa chuyển gen L2.1 và L2.2 có mức biểu hiện gen OsNAC1 thấp nhất, cao hơn xấp xỉ 10 lần so với cây lúa đối chứng (Hình 3.18).
Hình 3.18: Biểu hiện của OsNAC1 trong các dòng lúa chuyển gen Lip9:OsNAC1
Ghi chú:Mức độ biểu hiện c a gen chuyển trong các dòng lúa chuyển gen T2 (L1.1, L2.1,
L2.2, L4.1, L4.2 và L5.1) được so sánh với dịng lúa khơng chuyển gen (ĐC) thông qua bán định lượng mRNA bằng kĩ thuật RT-PCR với cặp mồi OsNAC1-RT-Fw/OsNAC1-RT- Rv. (A) Sản phẩm RT-PCR được điện di trên gel agarose 1%. Giếng (-): đối chứng âm
(khơng có DNA khn); giếng +: đối chứng dương (khuôn là pBI-Lip9/OsNAC1); giếng
ĐC: khuôn là mẫu RNA tách chiết từ cây lúa không chuyển gen. (B) Đồ thị so sánh hàm
lượng mRNA OsNAC1 tương quan giữa các dòng lúa. Mức độ biểu hiện c a OsNAC1 trong cây lúa khơng chuyển gen có giá trị bằng 1. Gen actin được sử dụng làm gen nội chuẩn.
gen đích nhiều phƣơng pháp khác nhau có thể đƣợc sử dụng nhƣ phƣơng pháp lai RNA, Readtime PCR, RT-PCR. Trong đó, phƣơng pháp RT-PCR đƣợc sử dụng khá phổ biến trong nghiên cứu mức độ biểu hiện gen đích do tính đơn giản và chính xác. Ví dụ, Gao và nhóm nghiên cứu đã xác định sự biểu hiện của gen OsNAC52 trong
cây thuốc lá chuyển gen bằng phƣơng pháp RT-PCR [51]. Tƣơng tự, để phân tích biểu hiện gen PDH45 trong cây lạc, Manjulatha và cộng sự cũng sử dụng phƣơng
pháp án định lƣợng mRNA bằng kĩ thuật RT-PCR [92]. Trong nghiên cứu của Bhauso và cộng sự, sự biểu hiện gen đích mtlD thơng qua tích luỹ mRNA trong các dịng lạc chuyển gen đã đƣợc chứng minh bằng phƣơng pháp RT-PCR; các dòng lạc biểu hiện gen mtlD tăng khả năng chống chịu mất nƣớc [26]. Alonso và nhóm nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp RT-PCR để so sánh sự tích lũy mRNA của gen đích tra trong tế bào ni ở 37oC và 30oC [40]. Trong nghiên cứu này, bằng phƣơng pháp RT-PCR, sự biểu hiện của gen OsNAC1 đã đƣợc xác định thơng qua sự tích luỹ mRNA trong các
dòng lúa chuyển gen với mức độ khác nhau.
3.4. ĐÁNH GIÁ SINH TRƢỞNG PHÁT TRIỂN VÀ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÁC DÒNG LÚA CHUYỂN GEN HẠN CỦA CÁC DÒNG LÚA CHUYỂN GEN
3.4.1. Đánh giá sinh trƣởng, phát triển của các dòng lúa chuyển gen T2
Các dòng lúa chuyển gen và dịng lúa đối chứng khơng chuyển gen ở giai đoạn 3 lá có kích thƣớc tƣơng đƣơng nhau đƣợc đƣa ra chậu đất và cho sinh trƣởng trong nhà lƣới với c ng điều kiện chăm sóc. Các chỉ tiêu về chiều cao cây, thời gian sinh trƣởng, khả năng đẻ nhánh và số hạt chắc/ ông đƣợc sử dụng để đánh giá sinh trƣởng và phát triển của các dòng lúa.
Kết quả đánh giá cho thấy, về hình thái học, các dịng lúa chuyển gen khơng có sự khác biệt với c y đối chứng. Tuy nhiên, khi phân tích chi tiết các đặc điểm sinh trƣởng, các dòng lúa chuyển gen có sự khác biệt tƣơng đối rõ rệt. Cụ thể, 5/11 dòng lúa chuyển gen (các dịng L1.1, L4.1, L4.2, U4.2 và U6.1) có kiểu hình bình thƣờng với các chỉ tiêu sinh trƣởng, phát triển (chiều cao, số nhánh/khóm, số hạt
chắc trên bơng, thời gian sinh trƣởng) tƣơng đƣơng dịng đối chứng. 6/11 (các dòng L2.1, L2.2, L5.1, U2.1, U3.1 và U5.1) dịng lúa lại có các chỉ tiêu phát triển (chiều cao, số nhánh/khóm và số hạt chắc/bơng) thấp hơn, trong khi thời gian sinh trƣởng dài hơn so với c y đối chứng (Hình 3.19, L2.1, L2.2, L5.1, U2.1, U3.1 và U5.1).
Hình 3.19: Đánh giá khả năng sinh trƣởng của các dòng lúa chuyển gen
Ghi chú: Chỉ tiêu sinh trưởng về chiều cao cây, số nhánh/khóm, số hạt chắc/bơng và thời
gian sinh trưởng c a các dòng lúa được chuyển cấu trúcLip9:OsNAC1 (L1.1, L2.1, L2.2, L4.1, L4.2 và L5.1) và Ubi:OsNAC (U2.1, U3.1, U4.2, U5.1 và U6.1) được so sánh với cây lúa J02 không chuyển gen (ĐC).
Dựa trên kết quả đánh giá khả năng sinh trƣởng và phát triển của 11 dòng lúa chuyển gen, 5 dòng L1.1, L4.1, L4.2, U4.2 và U6.1 đã đƣợc chọn cho thí nghiệm đánh giá khả năng chịu hạn.
Các nghiên cứu trƣớc đ y về gen mã hóa nh n tố phiên mã nhóm NAC ở lúa đã chỉ ra rằng, c y lúa đƣợc chuyển gen OsNAC1, OsNAC5, OsNAC10 và OsNAC045 có tính chống chịu cao hơn với điều kiện hạn và mặn nhƣng không ị ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng phát triển [66, 75, 137]. Tuy nhiên, trong nghiên cứu của nhóm tác giả Shinozaki, sự iểu hiện của OsNAC6 trong các c y lúa chuyển gen giúp tăng cƣờng chống chịu hạn, mặn và lạnh, nhƣng c y chuyển gen có khả năng sinh trƣởng k m và năng suất hạt thấp [99]. Trong nghiên cứu của Hong và các cộng sự, sự iểu hiện mạnh của OsNAC022 trong c y lúa chuyển gen giúp tăng cƣờng tính chống chịu với ất lợi
thời tiết hạn và mặn. X t về đặc điểm hình thái, c y lúa chuyển gen khơng khác iệt so với c y đối chứng nhƣng x t chi tiết về từng chỉ tiêu sinh trƣởng và chỉ tiêu về năng suất thì c y lúa chuyển gen OsNAC022 g y ảnh hƣởng tiêu cực đến sinh trƣởng và năng
suất so với c y đối chứng [62]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, các cây lúa chuyển gen OsNAC1 có đặc điểm hình thái khơng khác biệt so với c y đối chứng, một số
dịng có các chỉ tiêu sinh trƣởng, phát triển tƣơng đƣơng c y đối chứng trong điều kiện gieo trồng nhà lƣới. Các dòng này đƣợc lựa chọn tiếp tục trong nghiên cứu đánh giá khả năng chịu hạn.
3.4.2. Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen
Ba dòng lúa chuyển cấu trúc Lip9:OsNAC1 (L1.1, L4.1, L4.2) và hai dòng lúa chuyển cấu trúc Ubi:OsNAC1 (U4.2 và U6.1) có chỉ số sinh trƣởng, phát triển tƣơng đƣơng với c y đối chứng đƣợc lựa chọn để ph n tích đánh giá khả năng chịu hạn dựa trên các chỉ tiêu về hình thái, sinh lý, sinh hóa và khả năng sống sót sau giai đoạn ngừng tƣới nƣớc. Các thí nghiệm đƣợc tiến hành lặp lại 3 lần, số liệu đƣợc xử lý thống kê bằng phần mềm excel.
3.4.2.1. Đánh giá khả năng chịu hạn thông qua chỉ tiêu hình thái
tiêu, trong đó mức độ cuốn lá là chỉ tiêu hình thái thể hiện rõ ràng và phản ánh trực quan tác động của hạn cũng nhƣ khả năng chịu hạn của dòng/giống lúa. Khi lúa bị tác động bởi hạn, đầu lá lúa có xu hƣớng cuộn lại và giảm góc độ lá. Điều này có tác dụng giảm cƣờng độ bức xạ trên bề mặt lá, tăng cƣờng ánh sáng đi xuống phía dƣới và giúp duy trì trạng thái thốt hơi nƣớc bề mặt lá ở mức độ tối thiểu. Dựa vào đặc điểm này, chỉ tiêu về độ cuốn lá đã đƣợc sử dụng trong đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen và dòng lúa đối chứng không chuyển gen trong điều kiện gây hạn nhân tạo vào giai đoạn làm đòng và đƣợc đánh giá sau 2 tuần kể từ khi ngừng tƣới nƣớc.
Hình 3.20: Các dịng lúa sau 2 tuần xử lý hạn
Ghi chú: Các dòng lúa được chuyển cấu trúc Lip9:OsNAC1 (L1.1, L4.1 và L4.2) và
Ubi:OsNAC (U4.2 và U6.1) ở giai đoạn bắt đầu làm đòng được xử lý hạn ngừng tưới nước 2 tuần và so sánh với dòng lúa J02 không chuyển gen (ĐC).
Kết quả thu đƣợc cho thấy tất cả các dịng lúa thí nghiệm (L1.1, L4.1, L4.2, U4.2, U6.1 và dòng lúa đối chứng đều bị ảnh hƣởng bởi tác động của hạn (thể hiện mức độ cuốn lá sau 2 tuần gây hạn nhân tạo). Tuy nhiên, mức độ chịu ảnh hƣởng của các dịng lúa khác nhau là khác nhau (Hình 3.20, Bảng 8). Dòng lúa đối chứng chịu hạn kém nhất, biểu hiện độ cuốn lá nằm trong thang điểm trung bình là 7,8 (lá
cuốn trịn hình chữ O đến cuốn chặt). Tất cả 5 dịng lúa chuyển gen đều có khả năng chịu hạn cao hơn dịng đối chứng, thể hiện độ cuốn lá nằm trong thang điểm 4,2 – 6,2. Đặc biệt dịng lúa chuyển gen L1.1 có khả năng chịu hạn tốt nhất với mức độ biểu hiện lá ở thang điểm là 4,2. Nhƣ vậy, xét theo thang điểm chuẩn IRRI, thứ tự chịu hạn giảm dần của các dòng lúa nhƣ sau: L1.1, U6.1, L4.1, L4.2, U4.2, ĐC.
Bảng 3.8: Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen dựa trên độ cuốn lá
STT Dòng lúa Thang điểm
1 ĐC 7,8 ± 1,09 2 L1.1 4,2 ± 1,09 3 L4.1 5,0 ± 1,41 4 L4.2 5,4 ± 1,67 5 U4.2 6,2 ± 1,09 6 U6.1 4,6 ± 1,67
Ghi chú: L1.1, L4.1, L4.2: các dòng lúa được chuyển cấu trúc biểu hiện gen Lip9:
OsNAC1. U4.2 và U6.1: các dòng lúa được chuyển cấu trúc biểu hiện gen Ubi:OsNAC1. ĐC: dịng lúa J02 khơng chuyển gen. Thang điểm được chấm từ 1-9, trong đó: điểm 1 thể hiện thể khả năng chịu hạn cao nhất, điểm 9: thể hiện khả năng chịu hạn thấp nhất.
3.4.2.2. Đánh giá khả năng chịu hạn thông qua các chỉ tiêu sinh lý
Hàm lượng nước tương đối
Nƣớc là yếu tố cấu trúc và ổn định của cơ thể thực vật. Hàm lƣợng nƣớc trong c y có ý nghĩa quyết định đến mọi hoạt động của c y. Để các hoạt động sống diễn ra một cách ình thƣờng các tế bào và mô của cây phải chứa một lƣợng nƣớc nhất định. Tuy nhiên, hàm lƣợng nƣớc trong cây phụ thuộc nhiều vào điều kiện môi trƣờng sống. Trong điều kiện hạn, hàm lƣợng nƣớc trong mô của các c y khác nhau cũng khác nhau, điều đó ảnh hƣởng đến các hoạt động sinh lý, sinh hóa của cây. Vì vậy, hàm lƣợng nƣớc tƣơng đối (Relative water content –
RWC đƣợc coi là chỉ tiêu sinh lý đánh giá khả năng chịu hạn của cây trồng [91]. Trong nghiên cứu đánh giá khả năng chịu hạn ở các dòng lúa chuyển gen OsNAC1, RWC trong lá đƣợc xác định tại thời điểm trƣớc xử lý hạn ĐK thƣờng) và sau khi xử lý hạn 2 tuần ĐK hạn).
Kết quả trình bày trong Bảng 3.9 cho thấy trong điều kiện ình thƣờng, hàm lƣợng nƣớc tƣơng đối của các dòng lúa chuyển gen và dịng đối chứng khơng có sự sai khác nhiều, nằm trong khoảng 90% - 95%. Tuy nhiên, trong điều kiện hạn, hàm lƣợng nƣớc tƣơng đối của các dịng lúa thí nghiệm suy giảm đáng kể và thể hiện sự khác biệt rõ rệt giữa các dòng lúa chuyển gen với nhau và với dòng đối chứng (dao động 8% - 27% so với ĐK thƣờng). Trong khi dòng đối chứng, tỷ lệ RWC giảm mạnh nhất (27% so với ĐK thƣờng) thì ở dịng lúa chuyển gen giảm ít hơn trong khoảng 8% - 22% so với ĐK thƣờng). Đặc biệt, dịng lúa L1.1 có tỷ lệ RWC giảm thấp (giảm 8% so với ĐK thƣờng).
Bảng 3.9: Kết quả xác định h m lƣ ng nƣớc tƣơng đối trong dòng lúa chuyển gen Dòng lúa H m lƣ ng nƣớc tƣơng đối RWC (%)
ĐK thƣờng ĐK hạn Tỷ lệ RWC giảm ĐC 92 ± 0,02 67 ± 0,01 27 L1.1 95 ± 0,03 88 ± 0,03 8 L4.1 94 ± 0,06 81 ± 0,04 13 L4.2 90 ± 0,08 76 ± 0,06 16 U4.2 91 ± 0,05 71 ± 0,12 22 U6.1 93 ± 0,06 80 ± 0,03 14
Ghi chú:L1.1, L4.1, L4.2: dòng lúa chuyển cấu trúc Lip9: OsNAC1; U4.2 và U6.1: dòng
lúa chuyển cấu trúc Ubi:OsNAC1; ĐC: dịng lúa J02 khơng chuyển gen. ĐK thường: RWC trong lá được xác định tại thời điểm trước xử lý hạn. ĐK hạn: RWC trong lá được xác định tại thời điểm sau khi xử lý hạn 2 tuần. Tỷ lệ RWC giảm (%)= 1-(RWCĐK hạn /RWCĐK
thoát hơi nƣớc diễn ra mạnh hơn so với điều kiện thƣờng, nên hàm lƣợng nƣớc trong cây bị giảm đi. Mặt khác, tại cùng thời điểm gây hạn, c y có lƣợng nƣớc trong mơ lá cịn lại nhiều chứng tỏ c y đó có khả năng giữ nƣớc nhiều hơn nên có khả năng chịu hạn cao hơn. Dựa vào chỉ tiêu hàm lƣợng nƣớc tƣơng đối trong mô lá (Bảng 3.9), có thể xếp các dòng theo mức độ chịu hạn giảm dần nhƣ sau: L1.1, L4.1, U6.1, L4.2, U4.2, ĐC. Kết quả nghiên cứu này hoàn toàn