Chƣơng 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THẢO LUẬN
3.2. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN OsNAC1 TRONG TẾ BÀO THỰC VẬT
3.2.2. Thiết kế vector biểu hiện OsNAC1 điều khiển bởi promoter hoạt động
cảm ứng stress
Quá trình biểu hiện của các gen liên quan tới đáp ứng chống chịu điều kiện bất lợi của thực vật đƣợc điều khiển bởi một loạt các promoter cảm ứng stress [126]. Trong số đó, Rd29A và Lip9 là hai promoter cảm ứng với các điều kiện môi trƣờng bất lợi nhƣ hạn, mặn, lạnh và đã đƣợc nghiên cứu rất chi tiết. Để phục vụ thí nghiệm nghiên cứu chuyển gen OsNAC1 vào lúa, đề tài tiến hành thiết kế cấu trúc
biểu hiện gen OsNAC1, sử dụng promoter hoạt động cảm ứng stress Rd29A và Lip9. Trình tự mã hoá của OsNAC1 đƣợc ghép nối vào vector pCAMBIA1301 tại vị trí
nằm giữa promoter Rd29A/ Lip9 và vùng tín hiệu kết thúc phiên mã (poly-A) theo
sơ đồ trình bày ở Hình 2.1.
3.2.2.1.Ghép nối đoạn gen OsNAC1 vào vector pCAM-Rd29A và pCAM-Lip9
Vector pCAM-Rd29A và pCAM-Lip9 là vector pCAMBIA1301 (một Ti plasmid nhân tạo có mang cấu trúc biểu hiện gen chọn lọc kháng Hygromycin và
vùng MCS và thiết kế để biểu hiện gen đích trong tế bào thực vật đƣợc đƣa thêm promoter Rd29A/Lip9 trƣớc vị trí MCS (Hình 2.1). Trong thí nghiệm này, đoạn gen
OsNAC1 (Hình 3.8 đƣợc cắt khỏi vector pGEM/OsNAC1 (Hình 3.8, mục 0) và ghép
nối vào vector pCAM-Rd29A và pCAM-Lip9 mạch thẳng đã đƣợc xử lý trƣớc đó ằng enzyme cắt giới hạn BamHI (Hình 3.11) nhờ sự xúc tác của T4 DNA ligase. Hỗn hợp phản ứng sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào E. coli DH5α để sàng lọc thể biến nạp trên mơi trƣờng LB có chứa Kanamycin 50 µg/ml.
Hình 3.11: Xử lý vectorpCAM-Rd29A và pCAM-Lip9 bằng enzyme cắt giới hạn BamHI
Ghi chú: Sản phẩm cắt enzyme giới hạn được điên di trên gel agarose 1 %. Giếng 1, 2:
vector pCAM-Rd29A; giếng 3 và 4: vector pCAM-Lip9; giếng 1 và 3: sản phẩm cắt giới hạn BamHI; giếng 2 và 4: vector nguyên bản. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb.
Các thể biến nạp xuất hiện trên môi trƣờng chọn lọc đƣợc sàng lọc bằng PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu của promoter và gen đích là RD- Fw/NAC1-Rv đối với vectorpCAM-Rd29A/OsNAC1) và Lip9-Fw/NAC1-Rv đối với vector pCAM-Lip9/OsNAC1). Kết quả thu đƣợc cho thấy một số khuẩn lạc có mang đoạn gen OsNAC1, sản phẩm PCR từ các khuẩn lạc này khi đƣợc điện di trên gel agarose 1% cho 1 ăng DNA duy nhất có kích thƣớc lần lƣợt ~1,8 kb (Hình 3.12A, giếng 3 và 5) và 1,2 kb (Hình 3.12B, giếng 1 và 2), bao gồm kích thƣớc đoạn gen OsNAC1 và một phần trình tự đoạn promoter Rd29A và Lip9.
Hình 3.12: PCR trực tiếp khuẩn lạc mang pCAM-Rd29A/OsNAC1và pCAM- Lip9/OsNAC1
Ghi chú: Sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc được điện di trên gel agarose 1%. (A) PCR
khuẩn lạc được biến nạp pCAM-Rd29A /OsNAC1, giếng 1: đối chứng âm (khuôn là khuẩn lạc không biến nạp DNA); giếng 2-5: khuẩn lạc số 1-4. (B) PCR khuẩn lạc được biến nạp pCAM-Lip9/OsNAC1, giếng 1-2: khuẩn lạc số 1-2; giếng 3: đối chứng âm (khuôn là khuẩn lạc không biến nạp DNA). Giếng M: thang chuẩn DNA 1kb.
3.2.2.2. Kiểm tra vector tái tổ hợp pCAM-Rd29A/OsNAC1 và pCAM-Lip9/OsNAC1
Thể biến nạp có kết quả PCR dƣơng tính đƣợc ni cấy, tách chiết plasmid và kiểm tra sự có mặt của đoạn gen đích trong plasmid tái tổ hợp bằng PCR và phản ứng cắt enzyme giới hạn. Đối với PCR kiểm tra plasmid tinh chiết bằng cặp mồi đặc hiệu cho gen đích OsNAC1-Fw/OsNAC1-Rv và đặc hiệu promoter-gen RD-Fw/NAC1-Rv đối với pCAM-Rd29A/OsNAC1) & Lip9-Fw/NAC1-Rv đối với pCAM-Lip9/OsNAC1), sản phẩm PCR khi đƣợc điện di trên gel agarose cho các ăng DNA có kích thƣớc lần lƣợt ~1 kb (Hình 3.13A, giếng 1 và 5), 1,8 kb (Hình 3.13A, giếng 3) và 1,2 kb (Hình 3.13A, giếng 7). Đối với thí nghiệm cắt giới hạn bằng enzyme BamHI, sản phẩm phản ứng cho 2 ăng DNA, trong đó ăng DNA có kích thƣớc ~ 1,0 k tƣơng ứng với đoạn gen OsNAC1 (Hình 3.13B, giếng 1 và 3). Các kết quả này chứng tỏ đề tài đã thiết kế
thành công vector biểu hiện OsNAC1 đặt dƣới sự điều khiển của promoter cảm ứng
Hình 3.13: Kiểm tra plasmid tái tổ h p pCAM-Rd29A/OsNAC1 và pCAM- Lip9/OsNAC1 bằng PCR và cắt giới hạn
Ghi chú:Sản phẩm PCR và cắt giới hạn được điện di trên gel agarose 1%. (A) Sản phẩm
PCR plasmid tái tổ hợp; giếng 1 và 3: khuôn là pCAM-Rd29A/OsNAC1; giếng 5và 7: khuôn là pCAM-Lip9 /OsNAC1; giếng 1, 2,4 và 5: PCR với cặp mồi OsNAC1-Fw/OsNAC1-Rv; giếng 3 và 4: PCR với cặp mồi RD-Fw/OsNAC1-Rv; giếng 7 và 8: PCR với cặp mồi Lip9-Fw/OsNAC1- Rv; giếng 2, 4, 6 và 8: đối chứng âm (khơng có khn DNA). (B) S ản phẩm cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp bằng BamHI; giếng 1 và 2: pCAM-Rd29A/OsNAC1; giếng 3 và 4: pCAM- Lip9/OsNAC1; giếng 1 và 3: sản phẩm cắt giới hạn; giếng 2 và 4: plasmid nguyên bản. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb.
Các nghiên cứu trƣớc đ y về nhân tố phiên mã liên quan tới đáp ứng chống chịu yếu tố stress phi sinh học, bao gồm cả hạn hán, sử dụng rất phổ biến các cấu trúc promoter hoạt động mạnh, trong đó đặc biệt là promoter Ubiquitin và promoter
35S [40, 87, 109]. Promoter 35S có nguồn gốc từ virus CaMV Cauliflower Mosaic
Virus , kích thƣớc khá nhỏ vài trăm p và hoạt động rất mạnh ở hầu hết tất cả các loại tế bào/mô thực vật, trong mọi giai đoạn phát triển, đặc biệt là ở đối tƣợng cây hai lá mầm. Chính vì vậy, promoter 35S là cấu trúc đƣợc sử dụng rộng rãi và phổ biến nhất chiếm tới hơn 80% số lƣợng thực vật chuyển gen [68, 99]. Ubiquintin là một promoter hoạt động liên tục có nguồn gốc từ c y ngô đã đƣợc nghiên cứu chức năng khá chi tiết [35, 37, 106]. Do có khả năng hoạt hố sự biểu hiện gen ở mức độ cao (gấp 10 lần promoter 35S) trong tất cả các mơ/cơ quan có thể quan sát,
thực vật [37, 56]. Một số nghiên cứu về gen mã hoá nhân tố phiên mã nhƣ
OsDREB1, OsNAC5 hay OsNAC6 cũng đã sử dụng promoter này cho thí nghiệm
chuyển gen vào cây lúa mơ hình [72, 137, 141]. Trong nghiên cứu này, khung đọc mở của OsNAC1 đã đƣợc gh p nối với trình tự promoter Ubiquitin, 35S trên bộ
khung vector nhị ph n pBI101 để tạo vật liệu cho thí nghiệm chuyển gen OsNAC1 vào cây lúa.
Việc sử dụng các promoter hoạt động liên tục nhƣ 35S và Ubiquitin để
biểu hiện gen quan tâm trong cây chuyển gen thƣờng mang lại hiệu quả rõ rệt. Tuy nhiên, trong một số trƣờng hợp, sự biểu hiện liên tục của một gen đáp ứng điều kiện stress lại gây ảnh hƣởng tiêu cực tới sinh trƣởng và phát triển của thực vật trong điều kiện ình thƣờng [36, 98]. Một giải pháp cho vấn đề này là sử dụng các promoter chỉ cảm ứng hoạt động đặc hiệu trong những điều kiện stress nhất định, ví dụ nhƣ RD29A (A. thaliana), Lip9 (lúa), HVA22 (lúa mạch)... Promoter Lip9 là một trong số các promoter hoạt động đặc hiệu đƣợc phân lập từ lúa, đã đƣợc chứng minh cảm ứng với điều kiện hạn, mặn và ABA [99]. Các dòng lúa đƣợc chuyển cấu trúc Lip9:OsNAC6 hay Lip9:DREB1A bên cạnh khả năng chịu hạn cao cịn có tốc độ sinh trƣởng trong điều kiện bình thƣờng cao hơn rõ rệt so với các dòng lúa biểu hiện liên tục gen chuyển, chứng tỏ sự hoạt động của promoter Lip9 không gây ảnh hƣởng đến sinh trƣởng của cây chuyển gen [98, 141]. Ngoài ra, promoter Rd29A cũng đã đƣợc chứng minh cảm ứng hoạt động đặc hiệu trong những điều kiện stress bất lợi ngoại cảnh nhƣ hạn, mặn nhƣng không ảnh hƣởng tới sự phát triển của cây trồng nhƣ A. thaliana, thuốc lá,
mía,... [52, 135, 157]. Trong nghiên cứu này, cấu trúc biểu hiện gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNAC1 đặt dƣới sự điều khiển của nhiều promoter khác nhau (Lip9, Rd29A,
Ubiquitin và 35S) đã đƣợc thiết kế để đồng thời phục vụ cho cả nghiên cứu in vivo OsNAC1 trong cây chuyển gen và phục vụ mục tiêu xa hơn là tạo ra giống cây trồng