Chƣơng 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THẢO LUẬN
3.1. PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊNMÃ NHÓM NAC LIÊN
3.1.2. Phân lập gen mã hóa nhân tố phiênmã nhóm NAC liên quan tới tính
cây có lá cuốn hồn tồn hình chữ U ở mức điểm 5,67.
Độ cuốn lá là một trong những đáp ứng ở c y lúa trong điều kiện hạn. Nếu sức trƣơng tế ào duy trì dƣới điều kiện thiếu nƣớc thì độ cuốn lá diễn ra chậm. Tuy nhiên, dƣới điều kiện thiếu nƣớc nghiêm trọng, độ cuốn lá tăng để ngăn ngừa sự thoát hơi nƣớc và mất nƣớc, giúp duy trì thế nƣớc trong tế ào. Do đó, cuốn lá là một phản ứng thích nghi của c y lúa dƣới điều kiện thiếu nƣớc và độ cuốn lá đƣợc sử dụng nhƣ một tiêu chí đánh giá khả năng chịu hạn ở c y lúa [58, 118]. Phƣơng pháp đánh giá khả năng chịu hạn của các giống lúa theo tiêu chuẩn IRRI cũng dựa trên chỉ tiêu này để đánh giá khả năng chịu hạn của lúa. Nguyễn Văn Khoa và cs 2012 đã sử dụng phƣơng pháp IRRI để đánh giá chung khả năng chịu hạn của 19 giống lúa nƣơng, xác định đƣợc 12 giống lúa có khả năng chịu hạn từ tốt đến khá thang điểm từ 1-3) [6]. Tƣơng tự, Trần Thị Hƣơng Sen và cs 2017 cũng sử dụng phƣơng pháp thang điểm chuẩn IRRI dựa trên chỉ tiêu độ cuốn lá để đánh giá khả năng chịu hạn của 15 mẫu giống lúa mới, đã chọn ra một số giống lúa có khả năng chịu hạn tốt [10]. Trong nghiên cứu này, để đánh giá sơ ộ khả năng chịu hạn của 10 giống lúa nƣơng Việt Nam, thang điểm chuẩn của IRRI dựa trên đặc điểm hình thái về độ cuốn lá đã đƣợc sử dụng. Kết quả, trong số 10 giống lúa Việt Nam đƣợc khảo sát, giống lúa Tẻ Đỏ có khả năng chịu hạn cao nhất và đƣợc lựa chọn làm nguồn vật liệu trong thí nghiệm phân lập các gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan tới tính chịu hạn ở lúa.
3.1.2. Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan tới tính chịu hạn chịu hạn
Gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC là một trong những họ nhân tố phiên mã lớn đặc trƣng của thực vật và tham gia vào rất nhiều hoạt động chức năng quan trọng trong quá trình sinh trƣởng, phát triển và đáp ứng stress của thực
vật. Cho đến nay, khoảng 150 gen NAC đã đƣợc tìm thấy trong hệ gen lúa nhƣng chỉ một số ít gen thuộc nhóm gen này đƣợc nghiên cứu chức năng. Một số gen nhƣ SNAC1, OsNAC5, OsNAC10 đã đƣợc chứng minh có vai trị tăng cƣờng khả năng chống chịu hạn ở lúa. Sự biểu hiện tăng cƣờng của các gen này trong cây lúa chuyển gen tăng khả năng chống chịu stress hạn. Trong khi gen
OsNAC5 đƣợc chứng minh, sự tăng cƣờng biểu hiện của gen này làm tăng khả
năng chịu hạn ở các dịng lúa chuyển ở quy mơ phịng thí nghiệm thì vai trị cải thiện tính chống chịu hạn của SNAC1 và OsNAC10 đã đƣợc chứng minh bằng thực nghiệm trên quy mơ đồng ruộng [66, 75, 137]. Chính vì vậy, chúng tơi đã lựa chọn 3 gen mã hóa nhân tố phiên mã này là mục tiêu cho nghiên cứu phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan đến tính chịu hạn, phục vụ nghiên cứu tạo dịng lúa có khả năng chống chịu hạn cao.
3.1.2.1. Tách chiết RNA tổng số từ mẫu lúa xử lý hạn
Để phân lập các gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC, cây lúa non đƣợc xử lý hạn bằng PEG 20% trong thời gian khác nhau và tách chiết RNA tổng số để sử dụng cho phản ứng sinh tổng hợp cDNA.
Hình 3.1: Tách chiết RNA tổng số từ mẫu lúa xử lý hạn
Ghi chú: Sản phẩm RNA tinh sạch và PCR được điện di trên gel agarose 1%. (A) Sản phẩm RNA tinh sạch, giếng 1-4: mẫu RNA tổng số tách chiết từ lúa xử lý hạn trong 1, 6, 12 và 24 giờ; (B) Sản phẩm PCR nhân bản gen actin, giếng 1: đối chứng âm (khơng có RNA khn); giếng 2 - 5: khuôn là mẫu cDNA c a cây lúa Tẻ Đỏ xử lý hạn trong 1, 6, 12 và 24 giờ. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb Plus.
RNA tổng số. Hàm lƣợng RNA và độ tinh sạch của mẫu tách chiết đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo quang phổ ở ƣớc sóng A260nm và A280nm. Kết quả thu đƣợc cho thấy hàm lƣợng RNA trung bình trong các mẫu tách chiết đạt ~ 700 ng/µl và tỉ số OD268/OD280 trung bình nằm trong khoảng 1,85 – 2,03. Các kết quả này chứng tỏ mẫu RNA tách chiết có thể sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Để đảm bảo các mẫu RNA tách chiết đƣợc đạt yêu cầu chất lƣợng cho thí nghiệm phân lập gen bằng kỹ thuật RT-PCR, các mẫu tách chiết đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng tổng hợp cDNA và PCR nhân bản đoạn gen Actin. Kết quả
điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% cho thấy sự xuất hiện của ăng DNA có kích thƣớc khoảng 150 bp ở cả 4 phản ứng sử dụng khuôn là RNA tách chiết từ cây lúa Tẻ đỏ (Hình 3.1, giếng 2-5), trong khi mẫu đối chứng âm không xuất hiện ăng DNA này (Hình 3.1, giếng 1). Nhƣ vậy, các mẫu cDNA tổng hợp từ mẫu RNA tinh sạch với cặp mồi oligo-dT hoàn toàn đáp ứng đƣợc yêu cầu của thí nghiệm nhân bản gen đích. Sản phẩm của phản ứng tổng hợp cDNA này đƣợc sử dụng trực tiếp làm khuôn cho phản ứng PCR nhân bản gen NAC tiếp theo.
3.1.2.2. Phân lập các gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC
Nhân bản các gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC
Cặp mồi đặc hiệu để nhân bản vùng ORF của các gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 đƣợc thiết kế dựa trên trình tự các gen đƣợc công bố trên GenBank (mã
số AY5968081, AB028184.1 và AK069257.1) (Bảng 2.1). Các đoạn gen đích đƣợc nhân bản bằng phản ứng PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế, sau đó kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Kết quả ảnh điện di cho thấy tất cả các phản ứng PCR sử dụng khuôn là cDNA của lúa Tẻ đỏ xử lí stress hạn đều cho ăng DNA có kích thƣớc tƣơng ứng với kích thƣớc theo lý thuyết của gen đích, lần lƣợt là 951 bp (OsNAC1), 990 bp (OsNAC5) và 1,2 kb (OsNAC10) (Hình 3.2A, giếng 1; Hình 3.2B, giếng 2; Hình 3.2C, giếng 2). Ngƣợc lại, các phản ứng đối chứng âm sử dụng cDNA của mẫu lúa không xử lý hạn không thu đƣợc các ăng DNA này Hình
3.2A, giếng 2; Hình 3.2B, giếng 1; Hình 3.2C, giếng 1).
Hình 3.2: Nhân bản gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 bằng kỹ thuật PCR
Ghi chú: Sản phẩm PCR nhân bản gen đích từ các mẫu cDNA c a lúa Tẻ đỏ được điện di
trên gel agarose 1%. (A) PCR nhân bản gen OsNAC1, giếng 1: mẫu lúa xử lý hạn, giếng 2: đối chứng âm (mẫu lúa không xử lý hạn); (B) PCR nhân bản gen OsNAC5, giếng 2:
khuôn là cDNA; giếng 1: đối chứng âm. (C) PCR nhân bản gen OsNAC10, giếng 2: khuôn là cDNA; giếng 1: đối chứng âm. Giếng M: thang chuẩn DNA 1kb.
Kết quả thu đƣợc chứng tỏ 3 đoạn gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 đã đƣợc nhân bản từ cDNA của lúa Tẻ Đỏ xử lý stress hạn. Ngoài ra, kết quả này cũng ƣớc đầu cho thấy 3 gen đích cảm ứng biểu hiện với điều kiện stress hạn. Sản phẩm PCR sau đó đƣợc tinh sạch để sử dụng cho thí nghiệm nhân dịng gen tiếp theo.
Nhân dịng các gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC vào vector pGEM-T
Sản phẩm nhân bản OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 đƣợc tinh sạch nhằm loại bỏ toàn bộ các thành phần dƣ thừa của phản ứng PCR, sau đó gh p nối vào vector nhân dòng pGEM-T. Các đoạn gen đích đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng Taq DNA polymerase nên sản phẩm PCR sau khi đƣợc tinh sạch là các đoạn DNA có gắn thêm gốc AMP ở đầu 3’ và dễ dàng đƣợc nhân dòng trực tiếp vào vector nhân dịng mạch thẳng có đầu T (pGEM-T).
Thể biến nạp (khuẩn lạc trắng) xuất hiện trên mơi trƣờng chọn lọc có bổ sung chất kháng sinh Ampicillin, chất cảm ứng IPTG và cơ chất X-Gal đƣợc sàng lọc bằng phƣơng pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu để kiểm tra sự có mặt gen.
Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% cho thấy, với các phản ứng sử dụng khuôn là khuẩn lạc thu đƣợc các ăng DNA có kích thƣớc ~1,0kb (Hình 3.3A, giếng 3 & 5-8), 1 kb (Hình 3.3B, giếng 1-6 & 8) và ~1,2 kb (Hình 3.3C, giếng 4-9 , tƣơng tự nhƣ kích thƣớc ăng DNA của phản ứng đối chứng dƣơng sử dụng mẫu cDNA làm khn (Hình 3.3A, giếng 2; Hình 3.3B, giếng 9; Hình 3.3C, giếng 2 . Ngƣợc lại, đối với các phản ứng đối chứng âm sử dụng khuôn là khuẩn lạc không đƣợc biến nạp, kết quả điện di không thu đƣợc ăng DNA nào Hình 3.3A, giếng 1;Hình 3.3B, giếng 10; Hình 3.3C, giếng 1). Kết quả này cho ph p ƣớc đầu kết luận đã thu nhận đƣợc các khuẩn lạc dƣơng tính mang plasmid tái tổ hợp có chứa các gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10.
Hình 3.3: Sàng lọc thể biến nạp bằng PCR trực tiếp khuẩn lạc
Ghi chú: Sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc được điện di trên gel agarose 1%. (A) PCR
khuẩn lạc được biến nạp pGEM/OsNAC1; giếng 1: đối chứng âm (khuẩn lạc không được biến nạp); giếng 2: đối chứng dương (khuôn là cDNA c a lúa Tẻ Đỏ xử lý hạn); giếng 3-
8:khuôn là các khuẩn lạc trắng số 1-6. (B) PCR khuẩn lạc được biến nạp
pGEM/OsNAC5;giếng 1-8: khuôn là các khuẩn lạc trắng số 1-8; giếng 9: đối chứng dương; giếng 10:đối chứng âm. (C) PCR khuẩn lạc được biến nạp pGEM/OsNAC10;giếng 1:đối chứng âm; giếng 2: đối chứng dương; giếng 3-9: khuôn là khuẩn lạc trắng số 1-7. Giếng M: thang chuẩn DNA 1kb.
Khuẩn lạc dƣơng tính cho mỗi gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 đƣợc chọn để ni cấy, tách chiết DNA và sau đó kiểm tra bằng hai phƣơng pháp PCR và cắt enzyme giới hạn.
Kết quả điện di sản phẩm PCR trên Hình 3.4 cho thấy sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho các ăng DNA đúng với tính tốn lý thuyết của từng gen, lần lƣợt là 951 bp (Hình 3.4A, giếng 1), 990 bp (Hình 3.4B, giếng 4) và 1,2 kb (Hình 3.4C, giếng 1). Đối với sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi vector, kết quả thu đƣợc một ăng DNA có kích thƣớc lần lƣợt ~1,1 kb (Hình 3.4A, giếng 3), ~1,2 kb (Hình 3.4B, giếng 2) và ~1,4 kb (Hình 3.4C, giếng 3). Các kích thƣớc này hồn tồn phù hợp với kích thƣớc đoạn DNA theo tính tốn lý thuyết, bao gồm kích thƣớc nguyên bản của đoạn gen đích đƣợc chèn vào cộng với 186 bp của đoạn trình tự DNA nằm trên vector pGEM-T. Ngƣợc lại, đối với các phản ứng đối chứng âm không sử dụng DNA khuôn, kết quả điện di không thu đƣợc ăng DNA nào Hình 3.4A, giếng 2 và 4; Hình 3.4B, giếng 1 và 3; Hình 3.4C, giếng 2 và 4).
Hình 3.4: Kiểm tra plasmid tái tổ h p bằng PCR
Ghi chú: Sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp được điện di trên gel agarose 1%.(A) PCR
pGEM/OsNAC1, giếng 1 và 2: PCR với cặp mồi OsNAC1-Fw/OsNAC1-Rv; giếng 3 và 4:PCR với cặp mồi T7-Pro/SP6-Pro; giếng 1 và 3: khuôn là pGEM/OsNAC1; giếng 2 và 4: đối chứng âm (khơng có DNA khn). (B) PCR pGEM/OsNAC5, giếng 1 và 2: PCR với cặp mồi T7-Pro/SP6-Pro; giếng 3 và 4:PCR với cặp mồi OsNAC5-Rv/OsNAC5-Fw; giếng 2 và 4: khuôn là pGEM/OsNAC5; giếng 1 và 3: đối chứng âm (khơng có DNA khn). (C) PCR pGEM/OsNAC10, giếng 1 và 2: PCR với cặp mồi OsNAC10-Rv/OsNAC10-Fw; giếng 3 và 4: PCR với cặp mồi T7-Pro/SP6-Pro; giếng 1 và 3: khuôn là pGEM/OsNAC10; giếng 2 và 4: đối chứng âm (khơng có DNA khn).Giếng M: thang chuẩn DNA 1kb.
Để khẳng định chắc chắn hơn sự có mặt của đoạn DNA đích trong vector tái tổ hợp. Plasmid tinh sạch tiếp tục đƣợc kiểm tra bằng enzyme cắt giới hạn EcoRI có
hai vị trí nhận biết trên pGEM-T ở 2 đầu của đoạn DNA đƣợc chèn vào (Phụ lục 3).
Hình 3.5: Kiểm tra plasmid tái tổ h p bằng enzyme cắt giới hạn
Ghi chú: Sản phẩm cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp pGEM/OsNAC1 (A), pGEM/OsNAC5
(B) và pGEM/OsNAC10 (C) bằng EcoRI được điện di trên gel agarose 1%. Giếng 1: plasmid tái tổ hợp nguyên bản, giếng 2: sản phẩm cắt giới hạn, giếng M: thang chuẩn DNA 1kb.
Sản phẩm phản ứng cắt giới hạn pGEM/OsNAC1, pGEM/OsNAC5 và pGEM/OsNAC10 khi đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% đều cho 2 ăng DNA, trong đó ăng DNA thứ nhất có kích thƣớc khoảng 3,0 kb là bộ khung nguyên bản của vector pGEM-T và ăng DNA thứ hai có kích thƣớc lần lƣợt tƣơng ứng với kích thƣớc lý thuyết là 951bp (Hình 3.5A, giếng 2), 990bp (Hình 3.5B, giếng 2) và 1,2 kb (Hình 3.5C, giếng 2 tƣơng ứng kích thƣớc tính tốn lý thuyết của 3 gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10. Các kết quả thu đƣợc chứng tỏ các gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 từ lúa đã nh n dịng thành cơng vào vector pGEM-T.
Giải trình tự gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC
Để xác định các đoạn gen đã đƣợc phân lập từ giống lúa Tẻ Đỏ có đúng là các gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 mong muốn hay không, các vector tái tổ
hợp đƣợc giải trình tự DNA, sử dụng mồi T7-Pro và SP6-Pro. Kết quả giải trình tự sau đó đƣợc xử lý bằng phần mềm BioEdit 2.0 và phân tích bằng phần mềm Genetyx 4.0.
Kết quả giải trình tự gen cho thấy, kích thƣớc của 3 đoạn DNA đƣợc phân lập từ giống lúa Tẻ Đỏ lần lƣợt là 951 bp, 993 bp và 1182 bp. Các đoạn DNA này có trình tự Nu giống 99%, 98% và 92% so với gen OsNAC1 (AY596808.1),
OsNAC5 (AB028184.1) và OsNAC10 (AK069257.1) của giống lúa Nipon are đã đƣợc công bố trên Ngân hàng Gen thế giới. Trình tự OsNAC1 của lúa Tẻ Đỏ có 12 vị trí sai khác, nằm rải rác từ đầu 3’ đến đầu 5’ (Phụ lục 6) so với gen đã công bố; OsNAC5 phân lập đƣợc sai khác 17 vị trí Nu so với OsNAC5 của lúa Nipon are, trong đó có 2 vị trí thay thế nucleotit nằm phía đầu 3’, 15 vị trí sai khác cịn lại đều nằm phía đầu 5’ của gen. Đặc biệt, trên OsNAC5 của lúa Tẻ Đỏ có 2 vị trí sai khác lớn là mất ba Nu ở vị trí 577-579 (GTG) và thêm 6 Nu ở vị trí 802-807 (GACTAC) (Phụ lục 7). Trình tự gen OsNAC10 đã nh n dịng có sự sai khác lớn nhất so với trình tự đã cơng ố (53 vị trí), trong đó nhiều vị trí sai khác lớn tập trung ở đầu 5’ của gen (Phụ lục 8).
Kết quả phân tích trình tự axit amin suy diễn của các gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 của lúa Tẻ đỏ cho thấy, cả 3 gen phân lập đƣợc đều mã hóa cho protein với các domain đặc trƣng của họ protein NAC. OsNAC1, OsNAC5 chứa đầy đủ cả 5 domain bảo thủ A, B, C, D và E, trong khi OsNAC10
thiếu domain E (Hình 3.6). Ngồi ra, cả ba protein này đều chứa một vùng tín hiệu định vị nhân PRDRKYP phổ biến cho các nhân tố phiên mã, nằm ở domain C (Hình 3.6). Kết quả này hồn tồn phù hợp với các cơng bố trƣớc đ y về cấu trúc protein của các nhân tố phiên mã nhóm NAC [67, 75, 79, 136]. Nhƣ vậy, trình tự các gen
OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 phân lập từ giống lúa Tẻ Đỏ mặc dù có một số sai khác so với các gen đã đƣợc nghiên cứu và công bố nhƣng các sai khác chủ yếu tập trung ở phía đầu 5’ của gen và không gây ảnh hƣởng đến các domain đặc trƣng và quan trọng của nhân tố phiên mã NAC, do đó có thể khơng gây ảnh
hƣởng tới chức năng điều hòa phiên mã của các gen này.
Hình 3.6: Phân tích trình tự axit amin suy diễn của protein OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 của giống lúa Tẻ đỏ
Ghi chú:Vùng tín hiệu định vị nhân được kí hiệu bởi dấu ngoặc []; các vùng bảo th c a
protein NAC được kí hiệu A, B, C, D, E; (TĐ): gen phân lập từ lúa Tẻ Đỏ, (JA): gen phân lập từ lúa Japonica (Niponbare) đã công bố trên Ngân hàng gen mã số AY596808.1 (OsNAC1), AB028184.1 (OsNAC5) và AK069257.1 (OsNAC10).
3.1.3. Phân tích biểu hiện của OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 trong điều kiện hạn
Để đánh giá mức độ biểu hiện của các gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 trong cây lúaTẻ Đỏ ở điều kiện stress hạn, cây lúa non ba tuần tuổi đƣợc xử lý hạn giả định bằng cách ngâm rễ trong dung dịch PEG 20%. RNA tổng số của các mẫu
lúa đã xử lý hạn với khoảng thời gian khác nhau đƣợc tách chiết và sử dụng cho thí nghiệm phân tích án định lƣợng mRNA bằng kỹ thuật RT-PCR. Mẫu RNA tách chiết từ cây lúa ở thời điểm chƣa xử lý stress đƣợc sử dụng làm mẫu đối chứng âm.