Chƣơng 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THẢO LUẬN
3.3.5. Chọn lọc dòng lúa chuyển gen T2
Hạt của các dòng lúa chuyển gen T1 (L1.1, L2.1, L2.2, L4.1, L4.2, L5.1, U2.1, U4.1, U4.2, U5.1, U6.1) (cây T2) đƣợc gieo trên môi trƣờng MS có bổ sung kháng sinh chọn lọc Hygromycin. Những cây phát triển từ hạt nảy mầm trên môi trƣờng kháng sinh chọn lọc tiếp tục đƣợc kiểm tra mang cấu trúc gen chuyển bằng các cặp mồi đặc hiệu cho gen Actin, Hygromycin và cấu trúc OsNAC1:Nos. Những cây cho kết quả dƣơng tính với cả ba cặp mồi đƣợc sử dụng trong thí nghiệm xác
định mức độ biểu hiện của gen chuyển OsNAC1.
Mặc d đã xác định đƣợc sự có mặt của cấu trúc Ubi:OsNAC1 và
Lip9:OsNAC1 trong cây lúa chuyển gen T2, sự biểu hiện của OsNAC1 còn phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố nhƣ vị trí của cấu trúc biểu hiện gen trong hệ gen, sự tƣơng tác với các yếu tố điều hòa trong nhân... [24]. Trong nghiên cứu này, mức độ biểu hiện gen chuyển OsNAC1 trong các dòng lúa chuyển gen đƣợc xác định thơng qua hàm lƣợng mRNA OsNAC1 tích luỹ trong mô bằng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu OsNAC1-RT-Fw/OsNAC1-RT- Rv. RNA tổng số tách chiết từ lá các cây lúa T2 ở giai đoạn 3 lá non kháng Hygromycin và có kết quả kiểm tra PCR dƣơng tính (với 3 cặp mồi đặc hiệu cho gen Actin, Hygromycin và cấu trúc biểu hiện gen đích OsNAC1) đƣợc sử dụng làm khuôn cho các phản ứng RT-PCR. Mẫu RNA tổng số tách chiết từ cây lúa không chuyển gen đƣợc sử dụng làm mẫu đối chứng âm; gen Actin đƣợc sử dụng làm gen nội chuẩn. Mức độ biểu hiện của gen OsNAC1 trong cây chuyển gen đƣợc xác định tƣơng đối thông qua việc so sánh hàm lƣợng mRNA của cây lúa chuyển gen với c y lúa đối chứng không chuyển gen chỉ mang gen nội sinh.
Kết quả phân tích biểu hiện gen bằng RT-PCR cho thấy cả 5 dòng lúa chuyển cấu trúc Ubi:OsNAC1:Nos đƣợc kiểm tra có biểu hiện gen đích. Sử dụng
phần mềm ImageJ, mức độ biểu hiện gen OsNAC1 tƣơng quan giữa các dòng lúa
chuyển gen đã đƣợc xác định (Hình 3.17B). Kết quả so sánh cho thấy, gen đích
OsNAC1 đã iểu hiện ở tất cả 5 dòng lúa chuyển gen đƣợc kiểm tra, thể hiện ở hàm
lƣợng mRNA OsNAC1 trong cây chuyển gen cao hơn rõ rệt so với c y lúa đối
chứng không chuyển gen (cao gấp ~20 đến 40 lần so với c y lúa đối chứng). Mức độ biểu hiện của gen đích OsNAC1 giữa các dịng lúa chuyển gen có sự khác biệt. Cụ thể, hàm lƣợng mRNA OsNAC1 cao nhất đƣợc phát hiện ở dòng U3.1 và U5.1 (cao gấp 40 lần so với dòng đối chứng); 3 dòng U2.1, U4.2 và U6.1 có mức độ biểu hiện gen đích ở mức thấp hơn cao gấp 20 – 25 lần so với dòng đối chứng). (Hình 3.17B).
Hình 3.17: Biểu hiện của OsNAC1 trong các dòng lúa chuyển gen Ubi:OsNAC1
Ghi chú: Mức độ biểu hiện c a gen chuyển trong các dòng lúa chuyển gen T2 (U2.1, U3.1,
U4.2, U5.1 và U6.1) được so sánh với dịng lúa khơng chuyển gen (ĐC) thơng qua bán định lượng mRNA bằng kĩ thuật RT-PCR với cặp mồi OsNAC1-RT-Fw/OsNAC1-RT- Rv.
(A) Sản phẩm RT-PCR được điện di trên gel agarose 1%. Giếng(-): đối chứng âm (khơng
có DNA khn); giếng +: đối chứng dương (khuôn là pBI-Ubi/OsNAC1); giếng ĐC: khuôn là mẫu RNA tách chiết từ cây lúa không chuyển gen. (B) Đồ thị so sánh hàm lượng mRNA OsNAC1 tương quan giữa các dòng lúa. Mức độ biểu hiện c a OsNAC1 trong cây lúa khơng chuyển gen có giá trị bằng 1. Gen actin được sử dụng làm gen nội chuẩn.
Tƣơng tự, kết quả xác định mức độ biểu hiện gen OsNAC1 dƣới sự điều khiển biểu hiện của promoter hoạt động cảm ứng Lip9 cũng cho thấy gen đích đã iểu hiện ở tất cả 6 dòng lúa chuyển gen đƣợc kiểm tra và biểu hiện cao hơn rõ rệt so với c y đối chứng (gấp 10 – 30 lần). Tuy nhiên, mức độ biểu hiện của gen chuyển giữa các dòng lúa chuyển gen cũng có sự khác biệt tƣơng đối lớn. Trong đó, dịng L1.1 có mức độ
biểu hiện cao nhất, gấp 30 lần so với c y đối chứng; 3 dịng L1.1, L4.1 và L4.2 biểu hiện gen đích ở mức độ gấp ≥ 20 lần so với c y đối chứng; 2 dòng lúa chuyển gen L2.1 và L2.2 có mức biểu hiện gen OsNAC1 thấp nhất, cao hơn xấp xỉ 10 lần so với cây lúa đối chứng (Hình 3.18).
Hình 3.18: Biểu hiện của OsNAC1 trong các dòng lúa chuyển gen Lip9:OsNAC1
Ghi chú:Mức độ biểu hiện c a gen chuyển trong các dòng lúa chuyển gen T2 (L1.1, L2.1,
L2.2, L4.1, L4.2 và L5.1) được so sánh với dịng lúa khơng chuyển gen (ĐC) thông qua bán định lượng mRNA bằng kĩ thuật RT-PCR với cặp mồi OsNAC1-RT-Fw/OsNAC1-RT- Rv. (A) Sản phẩm RT-PCR được điện di trên gel agarose 1%. Giếng (-): đối chứng âm
(khơng có DNA khn); giếng +: đối chứng dương (khuôn là pBI-Lip9/OsNAC1); giếng
ĐC: khuôn là mẫu RNA tách chiết từ cây lúa không chuyển gen. (B) Đồ thị so sánh hàm
lượng mRNA OsNAC1 tương quan giữa các dòng lúa. Mức độ biểu hiện c a OsNAC1 trong cây lúa không chuyển gen có giá trị bằng 1. Gen actin được sử dụng làm gen nội chuẩn.
gen đích nhiều phƣơng pháp khác nhau có thể đƣợc sử dụng nhƣ phƣơng pháp lai RNA, Readtime PCR, RT-PCR. Trong đó, phƣơng pháp RT-PCR đƣợc sử dụng khá phổ biến trong nghiên cứu mức độ biểu hiện gen đích do tính đơn giản và chính xác. Ví dụ, Gao và nhóm nghiên cứu đã xác định sự biểu hiện của gen OsNAC52 trong
cây thuốc lá chuyển gen bằng phƣơng pháp RT-PCR [51]. Tƣơng tự, để phân tích biểu hiện gen PDH45 trong cây lạc, Manjulatha và cộng sự cũng sử dụng phƣơng
pháp án định lƣợng mRNA bằng kĩ thuật RT-PCR [92]. Trong nghiên cứu của Bhauso và cộng sự, sự biểu hiện gen đích mtlD thơng qua tích luỹ mRNA trong các dịng lạc chuyển gen đã đƣợc chứng minh bằng phƣơng pháp RT-PCR; các dòng lạc biểu hiện gen mtlD tăng khả năng chống chịu mất nƣớc [26]. Alonso và nhóm nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp RT-PCR để so sánh sự tích lũy mRNA của gen đích tra trong tế bào nuôi ở 37oC và 30oC [40]. Trong nghiên cứu này, bằng phƣơng pháp RT-PCR, sự biểu hiện của gen OsNAC1 đã đƣợc xác định thơng qua sự tích luỹ mRNA trong các
dòng lúa chuyển gen với mức độ khác nhau.