Ghi chú: Nhân tố phiên mã đáp ứng điều kiện hạn được chia thành hai nhóm phụ thuộc
ABA (màu đỏ) và không phụ thuộc ABA (màu đen). Các nhân tố phiên mã hoạt hoá (mũi tên màu xanh) hoặc ức chế (đường màu đỏ) sự biểu hiện c a một số gen đích (ơ màu vàng).
Cho đến nay, các TF tham gia trong mạng lƣới điều hòa hoạt động gen đáp ứng stress hạn đƣợc xác định thuộc hầu hết các nhóm TF lớn của thực vật, trong đó đƣợc nghiên cứu nhiều nhất là các nhóm AP2/ERF (APETALA 2/ethylene- responsive element binding factor), NAC (NAM/ATAF1/CUC2) và WRKY. Ngoài ra, một số nhân tố phiên mã thuộc các nhóm khác nhƣ MYB (myeloblastosis oncogene), bZIP (basic leucine zipper) cũng đƣợc chứng minh có tham gia vào q trình điều hịa hoạt động gen đáp ứng điều kiện stress hạn ở thực vật [86].
1.2.1.1. Nhân tố phiên mã AP2/ERF (APETALA2/EthyleneResponsive Element
Binding Protein)
AP2/ERF là họ nhân tố phiên mã đặc trƣng của thực vật, với khoảng 145 thành viên ở Arabidopsis và 170 thành viên ở lúa. Tất cả các TF thuộc họ này đều chứa một domain liên kết DNA bảo thủ, với tên gọi là vùng AP2. Vùng AP2 có chiều dài khoảng 60 axit amin, có vai trị tƣơng tác với phân tử DNA. Mỗi AP2 gồm hai tiểu phần, bao gồm tiểu phần YRG (yếu tố YRG) nằm phía đầu N và tiểu phần RAYD (yếu tố RAYD) nằm phía đầu C. Tiểu phần YRG dài khoảng 20 axit amin, giàu các gốc ƣu nƣớc, có chức năng tƣơng tác trực tiếp với phân tử DNA. Tiểu phần RAYD dài khoảng 40 axit amin, trong đó có một đoạn trình tự dài 18 axit amin có khả năng tạo thành một chuỗi xoắn α đóng vai trị quyết định cấu trúc và chức năng của v ng. RAYD đƣợc dự đoán tham gia vào tƣơng tác protein-protein nhờ cấu trúc xoắn α hoặc có vai trị làm thay đổi hoạt tính liên kết DNA của nhân tố phiên mã AP2/ERF thông qua sự tƣơng tác giữa bề mặt ƣa nƣớc của chuỗi xoắn α với rãnh chính trên phân tử DNA. Các protein liên kết với yếu tố cis DRE/CRT có chứa các gốc axit amin bảo thủ đặc trƣng trong v ng AP2 quyết định vai trò liên kết DNA của toàn bộ phân tử protein [97, 104, 117].
Dựa trên sự tƣơng đồng về trình tự axit amin và số lƣợng vùng AP2, họ protein AP2/ERF đƣợc chia thành 4 phân họ riêng biệt, bao gồm ERF, AP2, RAV và DREB (ehydration-responsive element-binding protein). Trong đó, phân họ DREB đƣợc nghiên cứu nhiều nhất, trên nhiều đối tƣợng thực vật khác nhau, bao gồm Arabidopsis, lúa, khoai tây, ngơ... Ở Arabidopsis, nhóm TF DREB gồm 8 gen, trong đó gen DREB2A và DREB2B là 2 gen cảm ứng mạnh với hạn, mặn và nhiệt độ cao theo con đƣờng không phụ thuộc ABA [140]. Biểu hiện của DREB1A dƣới
sự điều khiển của một promoter cảm ứng stress đã cải thiện đặc tính trổ bơng, giúp tăng sản lƣợng thu hoạch trong điều kiện hạn của dòng lúa chuyển gen so với dòng đối chứng [97]. Cây lúa chuyển gen biểu hiện tăng cƣờng OsDREB2A cũng có tỉ lệ
sống sót cao hơn so với cây đối chứng trong điều kiện hạn và mặn [104].
1.2.1.2. Nhân tố phiên mã WRKY
WRKY là một trong những họ nhân tố phiên lớn nhất của thực vật. Nhân tố phiên mã WRKY đƣợc đặt tên theo đặc điểm của vùng liên kết DNA và đƣợc gọi là vùng WRKY. Vùng này chứa một trình tự axit amin có tính bảo thủ rất cao là WRKYGQK ở đầu N và một cấu trúc zinc finger ở đầu C. Vùng WRKY bao gồm khoảng 60 gốc axit amin, tạo thành bốn chuỗi xoắn β đối song song có chứa các gốc Cys/His liên kết với ion kẽm (Zn) nằm ở vị trí Cx4-5Cx22-23HxH (C2H2) hoặc Cx7Cx23HxC (C2HC). Cả hai trình tự WRKY và ZF quyết định hoạt tính liên kết DNA của protein WRKY.Ngồi hai cấu trúc bảo thủ là vùng WRKY và trình tự ZF, các protein WRKY còn chứa một số cấu trúc đặc trƣng của các nhân tố phiên mã, bao gồm tín hiệu định vị nhân NLS, leucine zipper, vùng giàu Ser-Thr, vùng giàu Gln, vùng giàu Pro, vùng kinase và TIR-NBS-LRR [11, 34]. Vùng WRKY liên kết với một trình tự DNA đặc trƣng trên promoter của gen đích là hộp W (TTGACC/T). Chuỗi β1chứa trình tự WRKYGQK của vùng WRKY có chức năng tƣơng tác với rãnh chính của phân tử DNA. Các gốc axit amin trong trình tự WRKYGQK nhận biết DNA chủ yếu dựa trên các tƣơng tác không ph n cực với nhóm methyl của các azơ T nằm trong hộp W.
Dựa trên số lƣợng vùng WRKY và cấu trúc ZF, họ protein WRKY đƣợc chia thành ba phân họ. Phân họ WRKY I đặc trƣng với hai vùng WRKY và một cấu trúc C2H2 ZF. Phân họ WRKY II và III chỉ có một vùng WRKY và một cấu trúc C2H2 ZF (nhóm II) hay C2HC (nhóm III) [11]. Cho đến nay, nhiều gen WRKY đã đƣợc
chứng minh cảm ứng biểu hiện mạnh và sớm khi tế ào đáp ứng với các yếu tố stress vô sinh nhƣ hạn, mặn... Kết quả phân tích bằng phƣơng pháp lai RNA (Northern blot) cho thấy có 10 trong số 13 gen OsWWRKY (ở lúa đáp ứng khác nhau với các điều kiện mặn, hạn, lạnh và nóng [111]. Ở lúa mỳ cũng có 8 trong số 15 gen WRKY đáp ứng với stress hạn, mặn, lạnh và nóng [149].
1.2.1.3. Nhân tố phiên mã bZIP (Basic Leucine Zipper)
bZIP là họ nhân tố phiên mã quan trọng của thực vật. Họ TF này đƣợc nghiên cứu nhiều nhất trên đối tƣợng Arabidopsis, với khoảng 75 thành viên, đƣợc chia thành 10 nhóm dựa trên sự tƣơng đồng của các vùng chức năng trên chuỗi polypeptide. Cấu trúc của TF bZIP bao gồm 2 chuỗi xoắn α chứa một vùng liên kết DNA và một motif leucine-zipper đặc trƣng. Protein ZIP liên kết đặc hiệu với đoạn DNA chứa trình tự lõi ACGT trong vùng promoter của gen đích nhờ sự có mặt một số yếu tố cis đặc trƣng nhƣ A-box (TACGTA), C-box (GACGTC), G-box (CACGTG) hay ABRE (ACGTGT/GC) [74].
Một số yếu tố điều hòa bZIP hiện nay đã đƣợc xác định có tiềm năng áp dụng để tăng cƣờng khả năng chống chịu hạn của cây trồng. OsABF1, OsbZIP23 và
OsbZIP46 lúa đƣợc chứng minh giúp tăng cƣờng khả năng chống chịu hạn và mặn
của cây lúa chuyển gen. SlAREB cà chua tƣơng tác với cả promoter RD29B
(Arabidopsis) và LAP cà chua theo con đƣờng phụ thuộc ABA, qua đó tăng cƣờng khả năng chống chịu stress của cây chuyển gen mơ hình. Sự biểu hiện của
ZmbZIP37 giúp tăng cƣờng khả năng chống chịu hạn của của cây ngô chuyển gen
[74]. Các nghiên cứu này chứng tỏ vai trò quan trọng của nhân tố phiên mã bZIP trong điều hòa biểu hiện gen đáp ứng điều kiện bất lợi của thực vật.
1.2.1.4. Nhân tố phiên mã MYB (myeloblastosis)
MYB/MYC là họ nhân tố phiên mã có ở cả động vật và thực vật. Ở
Arabidopsis, TF họ MYB/MYC chiếm trên 10% tổng số gần 2000 gen mã hóa nhân
tố phiên mã.Về cấu trúc, protein MYB có 2 vùng chức năng ph n iệt, bao gồm: v ng đầu N là vùng MYB có vai trị liên kết DNA và v ng đầu C có vai trị điều hịa hoạt động của protein. Vùng MYB là một trình tự dài 52 axit amin, có thể lặp lại nhiều lần (tối đa có thể lặp lại 4 lần), mỗi đoạn lặp tạo thành 3 chuỗi xoắn α. Chuỗi xoắn thứ hai và thứ ba của mỗi trình tự lặp tạo thành cấu trúc HTH (helix- turn-helix) mang 3 gốc tryptophan (hay gốc kị nƣớc có vai trị điều hịa khơng gian,
hình thành nhân kị nƣớc trong cấu trúc 3D HTH. Ở thực vật, gốc tryptophan đầu tiên của trình tự lặp R3 đƣợc thay thế bằng phenylalanine hoặc isoleucine. Dựa trên số lƣợng vùng MYB, họ protein MYB đƣợc chia thành 4 phân họ, bao gồm 1R-MYB, 2R-MYB, 3R-MYB và 4R-MYB. Protein R2R3-MYB đặc trƣng cho giới thực vật, với khoảng trên 100 thành viên ở các loài một lá mầm và hai lá mầm khác nhau [15, 20].
Ở thực vật, nhiều nhân tố phiên mã MYB đã đƣợc chứng minh tham gia vào các con đƣờng đáp ứng yếu tố stress phi sinh học. Ví dụ, AtMYB2, AtMYB74 và AtMYB102 đƣợc tăng cƣờng biểu hiện bởi yếu tố stress hạn. AtMYB60 và AtMYB96 hoạt động thơng qua chuỗi truyền tín hiệu ABA để kiểm soát sự di
chuyển của khí khổng, qua đó tăng tính chịu hạn và bệnh tật cho cây. Hoạt động phiên mã của quá trình sinh tổng hợp sáp đƣợc điều hịa bởi MYB96, nhờ đó góp phần tăng tính chịu hạn của cây A. thaliana [15]. Chen và nhóm nghiên cứu
(2005 đã ph n lập đƣợc một gen MYB cảm ứng với stress hạn từ Boea crassifolia, đặt tên là BcMYB1. BcMYB1 mã hóa một protein thuộc nhóm R2R3-MYB. BcMYB1 đƣợc biểu hiện rất mạnh trong điều kiện stress hạn, đồng thời cũng cảm ứng với các điều kiện mặn và nhiệt độ thấp. Tƣơng tự, AtMYB102 của Arabidopsis cũng đáp ứng với
stress nƣớc [15]. Seo và Park (2009) gần đ y đã công ố nghiên cứu về một nhân tố phiên mã R2R3-MYB, đặt tên là MYB96, điều hịa q trình hoạt hóa mơ phân sinh rễ ên trong điều kiện hạn theo con đƣờng truyền tín hiệu ABA-auxin. Sự biểu hiện tăng cƣờng MYB96 dẫn tới kiểu hình sinh trƣởng cịi cọc, giảm hình thành rễ bên và
tăng khả năng chịu hạn. Các nghiên cứu ở lúa cũng đã phát hiện ra nhiều nhân tố phiên mã MYB liên quan tới đáp ứng chống chịu stress phi sinh học. Trong cây chuyển gen, sự biểu hiện tăng cƣờng của OsMYB3R-2 làm tăng khả năng chịu lạnh, hạn và mặn cho c y, đồng thời làm giảm tính nhạy cảm với ABA. Tƣơng tự, sự biểu hiện của
OsMYB55 cũng làm tăng sức chống chịu hạn và nhiệt độ cao của cây chuyển gen thông
qua cơ chế tăng cƣờng hoạt hóa q trình phiên mã của các gen tham gia vào trao đổi chất axit amin [15].
1.2.2. Nhân tố phiên mã NAC v vai trò đáp ứng stress hạn ở thực vật
NAC là nhân tố phiên mã lớn nhất đặc chƣng của thực vật, với khoảng 117 gen NAC ở Arbidopsis, 151 gen ở lúa, 79 gen ở nho, 26 gen ở cam quýt, 163 gen ở cây gỗ dƣơng, 152 gen ở đậu tƣơng và thuốc lá. Tên gọi NAC bắt nguồn từ tên của a proteinđầu tiên đƣợc phát hiện có chứa vùng liên kết DNA tƣơng tự nhau (domain NAC), bao gồm NAM (no apical meristem), ATAF (Arabidopsis transcription activation factor) và CUC (cup-shaped cotyledon) [13]. Nhân tố phiên mã NAC tham gia vào rất nhiều q trình sinh lý, hóa sinh khác nhau trong tế bào, bao gồm các q trình phát triển, già hóa, tạo thành tế bào thứ cấp, đáp ứng các yếu tố stress phi sinh học và hữu sinh. Nhân tố phiên mã NAC đƣợc chia thành 8 phân họ (từ NAC-a đến NAC-h) dựa trên mức độ tƣơng đồng của vùng NAC. Mỗi phân họ lại đƣợc phân chia tiếp thành một vài phân họ phụ dựa trên các trình tự bảo thủ ở đầu C. Kết quả phân tích cây phát sinh quan hệ di truyền của các protein NAC đã cho thấy các thành viên của họ protein này tập hợp theo từng phân nhóm dựa trên chức năng của chúng và những protein NAC đáp ứng stress đƣợc xếp vào chung một nhóm [43].
1.2.2.1. Đặc điểm cấu trúc của nhân tố phiên mã NAC
Các nhân tố phiên mã NAC đặc trƣng ởi một domain liên kết DNA phía đầu N có tính bảo thủ cao (domain NAC) và một domain điều hịa phía đầu C có sự thay đổi đa dạng giữa các nhóm protein NAC [45].
Domain NAC là một chuỗi peptide nằm ở phíađầu N gồm khoảng 150 - 160
gốc axit amin và đƣợc chia thành 5 domain đặt tên từ A đến E (Hình 1.2) [103]. Vùng bảo thủ C và D tích điện dƣơng có vai trị liên kết DNA; chức năng của vùng A liên quan đến quá trình hình thành cấu trúc dimer; vùng biến đổi B và E quyết định vai trò chức năng khác nhau giữa các protein NAC [103]. Cấu trúc tổng thể của một protein NAC dạng monomer là một chuỗi β xoắn đối song song β1-6/7) và đƣợc bao quanh bởi hai chuỗi xoắn α, chuỗi α1 phía đầu N và chuỗi α2 nằm bên trong. Đặc biệt, các gốc Val119-Ser183 β4-6; vùng D-E , Lys123 và Lys126 β4-5;
vùng D) cùng với Lys79, Arg85 và Arg88 β1-2; v ng C đƣợc xác định có vai trị quyết định khả năng liên kết DNA của domain NAC. Vị trí Arg88 có tính bảo thủ rất cao, trong khi hai vị trí Lys79 và Arg85 có thể thay thế cho nhau ở các protein NAC khác nhau, tạo nên sự đa dạng về ái lực với DNA. Ngồi ra, domain NAC cịn chứa một hoặc hai trình tự tín hiệu định vị nhân giúp tế bào nhận biết và vận chuyển protein vào nhân và chức năng này đƣợc quyết định các gốc Lys trong vùng D. Ngồi vai trị liên kết DNA, domain NAC cũng tham gia điều hịa q trình tƣơng tác của protein NAC với một số protein khác, có liên quan tới thời gian tồn tại và khả năng hoạt động của protein NAC [95, 108]. Tuy nhiên, đa số các protein NAC đều có cấu trúc dimer và đ y là một đặc điểm đặc trƣng của họ protein NAC. Domain NAC tham gia điều hịa q trình dimer hóa nhờ các gốc Leu14–Thr23 và Glu26–Tyr31. Các gốc axit amin này tạo thành một chuỗi β đối song song ngắn tại bề mặt giữa hai monomer và đƣợc ổn định nhờ hai gốc Arg19 và Glu26. Q trình dimer hóa có thể điều hịa tính đặc hiệu trong tƣơng tác protein-DNA của protein NAC. Các nhân tố phiên mã NAC khác nhau có khả năng nhận biết và liên kết đặc hiệu với các trình tự DNA khác nhau trên vùng promoter của gen đích [95].
Vùng điều hịa phiên mã nằm ở phía đầu C của protein NAC có tính đa dạng
rất cao, có vai trị quyết định đến khả năng điều hịa phiên mã của từng protein (hoạt hóa hoặc ức chế phiên mã)và đƣợc gọi là v ng điều hòa phiên mã (Transcription regulatory region - TRR). Vùng TRR có một số trình tự đặc trƣng giàu Ser-Thr, Pro-Glu hay các gốc có tính axit. Các nghiên cứu về đa dạng phân tử đã cho thấy các motif này bảo thủ giữa các phân nhóm trong cùng một nhóm protein NAC, nhƣng khác nhau giữa các nhóm khác nhau. Điều này chứng tỏ các motif này có vai trị khác nhau đối với mỗi loại protein NAC [45, 108].
Ở thực vật, để thích nghi với điều kiện mơi trƣờng biến đổi liên tục, tế bào có một cơ chế đáp ứng phiên mã nhanh với các kích thích bằng phản ứng cắt phân giải có kiểm sốt các nhân tố phiên mã liên kết màng (membrane associated transcription factor -
MTF). Trong vùng polypeptide đầu C của một số protein NAC có chứa vùng NLT đƣợc phát hiện có mang một cấu trúc xoắn α transmem rane motifs - TM) có chức năng liên kết protein với màng tế bào hay mạng lƣới nội chất. Cho đến nay, các nhà khoa học đã xác định đƣợc 18 NTL ở Arabidopsis, 11 NTL ở đậu tƣơng, 7 NTL ở ngô, 6 NTL ở nho, 5 NTL ở lúa và 4 NLT ở Medicago truncatula. Một số nghiên cứu đã chứng minh các NTL này đƣợc tăng cƣờng biểu hiện trong điều kiện stress và có thể liên quan tới các đáp ứng chống chịu của tế bào với các yếu tố stress của môi trƣờng [108, 122].