Ghi chú: Các dòng lúa được chuyển cấu trúc Lip9:OsNAC1 (L1.1, L4.1 và L4.2) và
Ubi:OsNAC (U4.2 và U6.1) ở giai đoạn bắt đầu làm đòng được xử lý hạn ngừng tưới nước 2 tuần và so sánh với dịng lúa J02 khơng chuyển gen (ĐC).
Kết quả thu đƣợc cho thấy tất cả các dịng lúa thí nghiệm (L1.1, L4.1, L4.2, U4.2, U6.1 và dòng lúa đối chứng đều bị ảnh hƣởng bởi tác động của hạn (thể hiện mức độ cuốn lá sau 2 tuần gây hạn nhân tạo). Tuy nhiên, mức độ chịu ảnh hƣởng của các dịng lúa khác nhau là khác nhau (Hình 3.20, Bảng 8). Dịng lúa đối chứng chịu hạn kém nhất, biểu hiện độ cuốn lá nằm trong thang điểm trung bình là 7,8 (lá
cuốn trịn hình chữ O đến cuốn chặt). Tất cả 5 dịng lúa chuyển gen đều có khả năng chịu hạn cao hơn dòng đối chứng, thể hiện độ cuốn lá nằm trong thang điểm 4,2 – 6,2. Đặc biệt dịng lúa chuyển gen L1.1 có khả năng chịu hạn tốt nhất với mức độ biểu hiện lá ở thang điểm là 4,2. Nhƣ vậy, xét theo thang điểm chuẩn IRRI, thứ tự chịu hạn giảm dần của các dòng lúa nhƣ sau: L1.1, U6.1, L4.1, L4.2, U4.2, ĐC.
Bảng 3.8: Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen dựa trên độ cuốn lá
STT Dòng lúa Thang điểm
1 ĐC 7,8 ± 1,09 2 L1.1 4,2 ± 1,09 3 L4.1 5,0 ± 1,41 4 L4.2 5,4 ± 1,67 5 U4.2 6,2 ± 1,09 6 U6.1 4,6 ± 1,67
Ghi chú: L1.1, L4.1, L4.2: các dòng lúa được chuyển cấu trúc biểu hiện gen Lip9:
OsNAC1. U4.2 và U6.1: các dòng lúa được chuyển cấu trúc biểu hiện gen Ubi:OsNAC1. ĐC: dịng lúa J02 khơng chuyển gen. Thang điểm được chấm từ 1-9, trong đó: điểm 1 thể hiện thể khả năng chịu hạn cao nhất, điểm 9: thể hiện khả năng chịu hạn thấp nhất.
3.4.2.2. Đánh giá khả năng chịu hạn thông qua các chỉ tiêu sinh lý
Hàm lượng nước tương đối
Nƣớc là yếu tố cấu trúc và ổn định của cơ thể thực vật. Hàm lƣợng nƣớc trong c y có ý nghĩa quyết định đến mọi hoạt động của c y. Để các hoạt động sống diễn ra một cách ình thƣờng các tế bào và mô của cây phải chứa một lƣợng nƣớc nhất định. Tuy nhiên, hàm lƣợng nƣớc trong cây phụ thuộc nhiều vào điều kiện môi trƣờng sống. Trong điều kiện hạn, hàm lƣợng nƣớc trong mô của các c y khác nhau cũng khác nhau, điều đó ảnh hƣởng đến các hoạt động sinh lý, sinh hóa của cây. Vì vậy, hàm lƣợng nƣớc tƣơng đối (Relative water content –
RWC đƣợc coi là chỉ tiêu sinh lý đánh giá khả năng chịu hạn của cây trồng [91]. Trong nghiên cứu đánh giá khả năng chịu hạn ở các dòng lúa chuyển gen OsNAC1, RWC trong lá đƣợc xác định tại thời điểm trƣớc xử lý hạn ĐK thƣờng) và sau khi xử lý hạn 2 tuần ĐK hạn).
Kết quả trình bày trong Bảng 3.9 cho thấy trong điều kiện ình thƣờng, hàm lƣợng nƣớc tƣơng đối của các dòng lúa chuyển gen và dịng đối chứng khơng có sự sai khác nhiều, nằm trong khoảng 90% - 95%. Tuy nhiên, trong điều kiện hạn, hàm lƣợng nƣớc tƣơng đối của các dịng lúa thí nghiệm suy giảm đáng kể và thể hiện sự khác biệt rõ rệt giữa các dòng lúa chuyển gen với nhau và với dòng đối chứng (dao động 8% - 27% so với ĐK thƣờng). Trong khi dòng đối chứng, tỷ lệ RWC giảm mạnh nhất (27% so với ĐK thƣờng) thì ở dịng lúa chuyển gen giảm ít hơn trong khoảng 8% - 22% so với ĐK thƣờng). Đặc biệt, dịng lúa L1.1 có tỷ lệ RWC giảm thấp (giảm 8% so với ĐK thƣờng).
Bảng 3.9: Kết quả xác định h m lƣ ng nƣớc tƣơng đối trong dòng lúa chuyển gen Dòng lúa H m lƣ ng nƣớc tƣơng đối RWC (%)
ĐK thƣờng ĐK hạn Tỷ lệ RWC giảm ĐC 92 ± 0,02 67 ± 0,01 27 L1.1 95 ± 0,03 88 ± 0,03 8 L4.1 94 ± 0,06 81 ± 0,04 13 L4.2 90 ± 0,08 76 ± 0,06 16 U4.2 91 ± 0,05 71 ± 0,12 22 U6.1 93 ± 0,06 80 ± 0,03 14
Ghi chú:L1.1, L4.1, L4.2: dòng lúa chuyển cấu trúc Lip9: OsNAC1; U4.2 và U6.1: dòng
lúa chuyển cấu trúc Ubi:OsNAC1; ĐC: dịng lúa J02 khơng chuyển gen. ĐK thường: RWC trong lá được xác định tại thời điểm trước xử lý hạn. ĐK hạn: RWC trong lá được xác định tại thời điểm sau khi xử lý hạn 2 tuần. Tỷ lệ RWC giảm (%)= 1-(RWCĐK hạn /RWCĐK
thoát hơi nƣớc diễn ra mạnh hơn so với điều kiện thƣờng, nên hàm lƣợng nƣớc trong cây bị giảm đi. Mặt khác, tại cùng thời điểm gây hạn, c y có lƣợng nƣớc trong mô lá cịn lại nhiều chứng tỏ c y đó có khả năng giữ nƣớc nhiều hơn nên có khả năng chịu hạn cao hơn. Dựa vào chỉ tiêu hàm lƣợng nƣớc tƣơng đối trong mô lá (Bảng 3.9), có thể xếp các dòng theo mức độ chịu hạn giảm dần nhƣ sau: L1.1, L4.1, U6.1, L4.2, U4.2, ĐC. Kết quả nghiên cứu này hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu trƣớc đ y trên các dòng lúa chuyển gen ONAC022 và AtDREB1A. Cây lúa biểu hiện gen AtDREB1A có RWC giảm ít hơn so với dịng lúa đối chứng trong điều kiện xử lý stress giả định [38, 62]. Tƣơng tự, tỷ lệ mất nƣớc ở các dòng lúa chuyển gen ONAC022 xấp xỉ 8 – 15% so với cây lúa không chuyển gen trong điều kiện hạn [62]. Điều này chứng tỏ sự biểu hiện của gen chuyển đã tác động đến cơ chế vận chuyển/dự trữ nƣớc của tế bào/mơ qua đó giúp c y lúa chuyển gen duy trì hàm lƣợng nƣớc tƣơng đối cao trong điều kiện hạn.
Hàm lượng diệp lục
Diệp lục là thành phần chính trong bộ máy quang hợp ở thực vật. Hàm lƣợng diệp lục trong lá đƣợc coi là chất chỉ thị cho hiệu suất quang hợp và là một trong các chỉ thị sinh lý để đánh giá khả năng chống chịu hạn của thực vật. Trong nghiên cứu này, hàm lƣợng diệp lục a (sắc tố tham gia trực tiếp vào các phản ứng sáng của quang hợp, có vai trị chuyển quang năng thành hóa năng trong các liên kết hóa học của NADPH và ATP), diệp lục b (sắc tố đóng vai trị quan trọng trong hấp thu năng lƣợng ánh sáng và chuyển năng lƣợng hấp thu đến diệp lục a) và diệp lục tổng số của các dòng lúa chuyển gen và dòng lúa đối chứng đã đƣợc xác định tại thời điểm trƣớc ĐK thƣờng) và sau khi xử lý hạn ĐK hạn).
dòng đối chứng đều giảm so với trƣớc khi xử lý hạn (16% - 40% so với điều kiện thƣờng). Sau khi xử lý hạn, hàm lƣợng diệp lục a ở dòng lúa đối chứng giảm mạnh nhất (40% so với điều kiện thƣờng), trong khi các dòng lúa chuyển gen giảm ít (16% - 32% so với điều kiện thƣờng). Đặc biệt, dịng lúa chuyển gen L1.1 có hàm lƣợng diệp lục a giảm thấp nhất (16% so với điều kiện thƣờng) (Bảng 3.10 . Nhƣ vậy, hàm lƣợng diệp lục a đƣợc duy trì ổn định, ít ị ph n giải hơn ở các dòng lúa chuyển gen so với dòng đối chứng ở điều kiện xử lý hạn.
Bảng 3.10: H m lƣ ng chất diệp lục a trong các dòng lúa chuyển gen
Dòng lúa H m lƣ ng chất diệp lục a (Chla) (µg/mg lá) ĐK thƣờng ĐK hạn Tỷ lệ h m lƣ ng giảm (%) ĐC 1,42 ± 0,04 0,86 ± 0,05 40 L1.1 1,44 ± 0,03 1,22 ± 0,05 16 L4.1 1,43 ± 0,03 1,15 ± 0,03 20 L4.2 1,41 ± 0,02 0,99 ± 0,07 30 U4.2 1,42 ± 0,04 0,97 ± 0,06 32 U6.1 1,43 ± 0,04 1,13 ± 0,03 21
Ghi chú:L1.1, L4.1, L4.2: dòng lúa chuyển cấu trúc Lip9: OsNAC1; U4.2 và U6.1: dòng
lúa chuyển cấu trúc Ubi:OsNAC1; ĐC: dịng lúa J02 khơng chuyển gen. Tỷ lệ hàm lượng giảm (%)= 1-(ChlaĐK hạn /ChlaĐK thường)*100%.
Kết quả ảng 3.11 cho thấy, sự giảm hàm lƣợng diệp lục cũng tƣơng ứng với sự giảm hàm lƣợng diệp lục a trong điều kiện hạn. Tất cả các dòng lúa chuyển gen và dòng đối chứng đều có hàm lƣợng diệp lục giảm so với thời điểm trƣớc khi xử lý hạn. Tƣơng tự diệp lục a, tỷ lệ hàm lƣợng diệp lục giảm không đồng đều giữa các dòng và cả 5 dòng lúa chuyển gen đều có tỷ lệ hàm lƣợng diệp lục 10% - 20% giảm ít hơn so với giống lúa đối chứng 33% . Cụ
thể, dịng lúa L1.1 có hàm lƣợng giảm khơng đáng kể 10% . Các dòng lúa L4.1, L4.2, U4.2 và U6.1 giảm 10% đến 20% so điều kiện thƣờng Bảng 3.11). Chứng tỏ hàm lƣợng diệp lục ở các dòng lúa chuyển gen cao hơn và ổn định hơn so với dòng đối chứng ở điều kiện hạn đồng nghĩa với khả năng chịu hạn ở các dòng lúa chuyển gen cao hơn dòng lúa đối chứng.
Bảng 3.11: H m lƣ ng chất diệp lục b trong các dòng lúa chuyển gen
Dòng lúa H m lƣ ng chất diệp lục b (Chlb) (µg/mg lá) ĐK thƣờng ĐK hạn Tỷ lệ h m lƣ ng giảm (%) ĐC 1,31 ± 0,05 0,88 ± 0,07 33 L1.1 1,21 ± 0,09 1,09 ± 0,09 10 L4.1 0,62 ± 0,02 0,52 ± 0,05 16 L4.2 0,58 ± 0,03 0,46 ± 0,06 11 U4.2 0,74 ± 0,06 0,57 ± 0,06 13 U6.1 0,76 ± 0,02 0,61 ± 0,08 20
Ghi chú:L1.1, L4.1, L4.2: dòng lúa chuyển cấu trúc Lip9: OsNAC1; U4.2 và U6.1: dòng
lúa chuyển cấu trúc Ubi:OsNAC1; ĐC: dịng lúa J02 khơng chuyển gen. Tỷ lệ hàm lượng giảm (%)= 1-(ChlbĐK hạn /ChlbĐK thường)*100%.
Hàm lƣợng diệp lục tổng số của cả 5 dòng lúa chuyển gen và dòng lúa đối chứng đều giảm trong điều kiện hạn (11% - 33%). Trong đó, hàm lƣợng diệp lục tổng số của dịng lúa khơng chuyển gen cũng giảm mạnh nhất (33%). Các dòng lúa chuyển gen có hàm lƣợng diệp lục tổng số ổn định hơn, đặc biệt dòng lúa L1.1 cũng có mức suy giảm ít nhất (11%), tiếp đến là các dòng L4.1 18%) và U6.1 (21%). Từ kết quả nghiên cứu trên cho thấy, nếu chỉ dựa vào chỉ tiêu hàm lƣợng diệp lục để đánh giá khả năng chịu hạn, các dịng lúa chuyển gen đều có khả năng chịu hạn tốt hơn dòng lúa đối chứng.
Bảng 3.12: H m lƣ ng chất diệp lục tổng số trong các dòng lúa chuyển gen Dòng lúa H m lƣ ng chất diệp lục tổng số (Chl) (µg/mg lá) ĐK thƣờng ĐK hạn Tỷ lệ giảm (%) ĐC 1,95 ± 0,09 1,31 ± 0,06 33 L1.1 3,24 ± 0,08 2,91 ± 0,09 11 L4.1 2,04 ± 0,14 1,69 ± 0,06 18 L4.2 1,87 ± 0,09 1,44 ± 0,07 23 U4.2 2,02 ± 0,11 1,50 ± 0,03 26 U6.1 2,03 ± 0,04 1,63 ± 0,04 20
Ghi chú:L1.1, L4.1, L4.2: dòng lúa chuyển cấu trúc Lip9: OsNAC1; U4.2 và U6.1: dòng
lúa chuyển cấu trúc Ubi:OsNAC1; ĐC: dịng lúa J02 khơng chuyển gen.Tỷ lệ hàm lượng giảm (%)= 1-(ChlĐK hạn/ChlĐK thường)*100%.
Hàm lƣợng diệp lục đóng vai trị quan trọng trong hoạt động quang hợp và khả năng chống chịu của cây trồng. Hàm lƣợng diệp lục càng cao, ít bị biến đổi, ổn định dƣới tác động bất lợi của ngoại cảnh thì cây quang hợp càng mạnh, khả năng chống chịu sẽ tốt hơn. Khi gặp điều kiện hạn, cấu trúc lục lạp bị hƣ hại, hoạt tính thủy phân của chlorophylase tăng lên, diệp lục bị phân giải, sự tổng hợp diệp lục a và b bị ức chế. Mặt khác, các gốc rƣợu ở phần đi diệp lục có tính ƣa lipit, dễ dàng gắn đƣợc vào màng thylacoit, đảm bảo độ bền vững và ổn định vị trí, hoạt tính của diệp lục. Nhƣng dƣới ảnh hƣởng của hạn, ROS đƣợc tạo ra sẽ dễ dàng oxy hóa lipit, dẫn đến sự phá hủy cấu trúc diệp lục, làm giảm hàm lƣợng diệp lục. Sự mất mát hay thay đổi hàm lƣợng diệp lục dƣới điều kiện hạn hán đã đƣợc nghiên cứu ở nhiều loài thực vật khác nhau... [16, 47]. Để đánh giá khả năng chịu hạn ở các dòng lúa chuyển gen, chỉ tiêu hàm lƣợng diệp lục đƣợc sử dụng nhƣ một chỉ tiêu sinh lý khá phổ biến trong các nghiên cứu. Trong nghiên cứu của Datta và
cộng sự (2012) chỉ ra rằng, hàm lƣợng diệp lục ở các dòng lúa chuyển gen
AtDREB1B đều ít biến đổi hơn so với dịng lúa đối chứng không chuyển gen khi xử
lý hạn [38]. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu của Hong và cộng sự 2016 trên đối tƣợng cây lúa chuyển gen ONAC022 [62]. Trong nghiên
cứu này, hàm lƣợng diệp lục ở các dịng lúa chuyển gen OsNAC1 cũng đƣợc duy
trì ổn định và ít biến đổi hơn so với dịng lúa đối chứng trong điều kiện hạn.
3.4.2.3. Đánh giá khả năng chịu hạn thông qua các chỉ tiêu sinh hóa
Hàm lượng proline
Proline là một trong số các chất hữu cơ hịa tan quan trọng nhất đƣợc tích lũy với hàm lƣợng rất cao dƣới điều kiện hạn, có vai trị duy trì áp suất thẩm thấu của tế ào, giữ ổn định cấu trúc các ph n tử protein, khử ROS và hoạt động nhƣ một ph n tử truyền tín hiệu stress của ộ máy đáp ứng stress. Việc tăng hàm lƣợng proline trong c y là phản ứng thông thƣờng, giúp tăng đáng kể khả năng chống chịu hạn của c y [25, 112, 114, 153]. Chính vì vậy, proline là một chất chỉ thị về khả năng chịu hạn của thực vật và sự tích lũy proline là biểu hiện của phản ứng thích nghi của cây khi gặp điều kiện hạn.
Trong thí nghiệm này, đề tài tiến hành xác định hàm lƣợng proline trong lá của các dòng lúa chuyển gen và dòng đối chứng trƣớc và sau khi xử lý hạn. Kết quả thể hiện ở Bảng 3.13 cho thấy sau 2 tuần ngừng tƣới nƣớc, hàm lƣợng proline tăng lên đáng kể cả ở các dòng lúa chuyển gen và dòng đối chứng so với điều kiện ình thƣờng. Tuy nhiên, sự gia tăng hàm lƣợng proline trong cây chuyển gen cao hơn so với c y đối chứng. Cụ thể, ở các dòng lúa chuyển gen, hàm lƣợng proline tăng từ 97,06% - 135,18% so với điều kiện thƣờng; trong khi ở c y đối chứng là 78,05%. Nhƣ vậy, x t chỉ tiêu sự tăng tích lũy hàm lƣợng proline trong c y, thứ tự chịu hạn dòng lúa chuyển gen lần lƣợt là L1.1, U6.1, L4.1, U4.2, L4.2, ĐC.
Bảng 3.13: H m lƣ ng proline trong các dòng lúa Dòng lúa H m lƣ ng proline (µg/mg) ĐK thƣờng ĐK hạn Tỷ lệ tăng (%) ĐC 121,2 ± 3,11 215,8 ± 9,42 78,05 L1.1 147,8 ± 5,07 347,6 ± 21,56 135,18 L4.1 131,8 ± 4,32 268,2 ± 7,56 103,49 L4.2 129,2 ± 3,03 254,6 ± 6,07 97,06 U4.2 137,2 ± 2,77 262,2 ± 8,23 102,94 U6.1 137,2 ± 2,75 282,2 ± 4,21 105,68
Ghi chú: L1.1, L4.1, L4.2: dòng lúa chuyển cấu trúc Lip9: OsNAC1; U4.2 và U6.1: dòng
lúa chuyển cấu trúc Ubi:OsNAC1; ĐC: dịng lúa J02 khơng chuyển gen. Tỷ lệ hàm lượng proline tăng (%)= (ProlineĐK hạn /ProlineĐK thường)%-100%.
Các nghiên cứu trƣớc đ y đã chỉ ra rằng có mối tƣơng quan giữa khả năng chịu hạn với sự gia tăng hàm lƣợng proline trên đối tƣợng c y chuyển gen nhƣ lúa [62], lạc [148], cà chua [112], ngơ [89]... Ở lúa, sự tích lũy hàm lƣợng proline cao ở các dòng lúa chuyển gen ONAC022 làm tăng khả năng chịu hạn so với c y lúa đối
chứng [62]. Ở Việt Nam đã có một số tác giả nghiên cứu về vai trò của proline đối với tính chịu hạn của cây trồng cũng cho các kết quả tƣơng tự. Ví dụ, tác giả Đinh Thị Phòng (2001) bằng việc xử lý lạnh, mặn, hạn trên các giống lúa đã cho thấy mối tƣơng quan giữa tính chống chịu của cây với sự gia tăng hàm lƣợng proline ở các giống lúa nghiên cứu [8].
Mức độ tích lũy chất oxy hoạt hóa H2O2
Stress hạn đƣợc chứng minh g y hƣ hỏng mạnh các thành phần của tế bào do kích thích sự sản sinh các chất oxy hoạt hóa (ROS - reactive oxygen species) H2O2, làm tăng cƣờng q trình peroxide hóa lipid, cản trở phản ứng phosphoryl oxy hóa trong quá trình đƣờng phân, dẫn tới ức chế sự tổng hợp ATP.