Chƣơng 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THẢO LUẬN
3.3.1. Biến nạp vector biểu hiện vào A.tumefaciens LBA4404
Để thực hiện thí nghiệm chuyển gen vào cây lúa, các chủng vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc biểu hiện gen (Ti-plasmid đƣợc tạo ra bằng
phƣơng pháp sốc nhiệt và sàng lọc bằng phƣơng pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc, sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho OsNAC1.
Hình 3.14: PCR trực tiếp khuẩn lạc mang pCAM-Rd/OsNAC1, pBI- 35S/OsNAC1, pBI-Ubi/OsNAC1và pCAM-Lip9/OsNAC1
Ghi chú: Sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc A. tumefaciens với cặp mồi OsNAC1-Fw/
OsNAC1-Rv được điện di trên gel agarose 1%. (A) Thể biến nạp pBI-35S/OsNAC1, pBI- Ubi/OsNAC1và pCAM-Lip9/OsNAC1, giếng 1 – 5: khuôn là thể biến nạp pBI- 35S/OsNAC1; giếng 6 – 9: khuôn là thể biến nạp pCAM-Lip9/OsNAC1; giếng 10 – 12: khuôn là thể biến nạp pBI-Ubi/OsNAC1; giếng 13: đối chứng âm (khuôn là khuẩn lạc không biến nạp DNA).(B) Thể biến nạp pCAM-Rd/OsNAC1, giếng 1: đối chứng âm (khuôn là khuẩn lạc không biến nạp DNA); giếng 2 – 4: khuôn là thể biến nạp pCAM- Rd/OsNAC1. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb.
Sản phẩm PCR từ các khuẩn lạc A. tumefaciens đƣợc biến nạp cấu trúc biểu hiện OsNAC1 với cặp mồi OsNAC1-Fw/OsNAC1-Rv khi đƣợc điện di trên gel agarose cho 1 ăng DNA duy nhất khoảng 1,0 k tƣơng ứng với kích thƣớc lý thuyết của gen đích Hình 3.14A, giếng 1-4, giếng 7-9, giếng 10-12; Hình 3.14B, giếng 2 và 4). Kết quả này chứng tỏ đề tài đã thu đƣợc các thể biến nạp A. tumefaciens có mang cấu trúc biểu hiện gen OsNAC1 điều khiển bởi các promoter
khác nhau (bao gồm pCAM-Rd/OsNAC1, pBI-35S/OsNAC1, pBI-Ubi/OsNAC1 và pBI-Lip9/OsNAC1).
bản pBI101 và pCAMBIA1301 cũng đƣợc biến nạp vào vi khuẩn A. tumefaciens để làm đối chứng âm trong thí nghiệm nghiên cứu tạo dịng lúa chuyển gen. Các thể biến nạp sau đó cũng đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc, sử dụng các cặp mồi đặc hiệu cho từng cấu trúc vector. Các thể biến nạp có kết quả PCR dƣơng tính đƣợc chọn để sử dụng làm đối chứng cho thí nghiệm chuyển gen vào lúa.
Hình 3.15: PCR trực tiếp khuẩn lạc mang pBI101 và pCAMBIA1301
Ghi chú: Sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc A. tumefaciens với mồi đặc hiệu cho gen
kháng Hygromycin (Hyg-Fw/Hyg-Rv) được điện di trên gel agarose 1 %. Gi ếng 1 – 4: khuôn là thể biến nạp pBI101; giếng 5: đối chứng âm (khuôn là khuẩn lạc không bi ến nạp DNA); giếng 6: đối chứng dương (khuôn là pBI101); giếng 8 – 13: khuôn là thể biến nạp pCAMBIA1301; gi ếng 7: đối chứng dương (khuôn là pCAMBIA1301). Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb.
Chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens là phƣơng pháp đƣợc sử
dụng thƣờng xuyên và hiệu quả nhất trong chuyển gen thực vật. Các chủng
A.tumefaciens đƣợc dùng phổ biến nhƣ LBA4404, EHA101, EHA105, AGL1...
Trong đó, chủng LBA4404 chứa các vector nhị phân sử dụng hiệu quả cho chuyển gen ngô. EHA101 và EHA105 là những chủng đƣợc lựa chọn để chuyển gen vào lúa mì. AGL1 đƣợc sử dụng trong chuyển gen vào lúa mạch và lúa miến. Các chủng
A. tumefaciens LBA4404 và EHA101 có hiệu quả tốt hơn các chủng khác trong các
nghiên cứu chuyển gen lúa [61]. Trong nghiên cứu này, chủng LBA4404 đã đƣợc sử dụng trong chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC liên quan đến tính chịu hạn vào lúa J02.