Methane Axetat, H2, CO
1.3.3. Đặc tính sinh học của VSVSMT
1.3.3.1. Cơ chất của q trình phân hủy kỵ khí sinh methane
Trong lĩnh giới Cổ khuẩn, VSVSMT làm thành một nhóm lớn và đa dạng với các đặc điểm chung là sinh trưởng kỵ khí bắt buộc và tạo khí methane như sản phẩm cuối cùng của chu trình trao đổi năng lượng. VSVSMT thu năng lượng cho q trình sinh trưởng từ việc chuyển hố H2 và một số chất hữu cơ thành khí methane. Nguồn cơ chất chủ yếu của các vi sinh vật này là hydro, format và acetate. Ngoài ra, một số hợp chất C1 như methanol, trimethylamin, dimethylsulfid và rượu như isopropanol, isobutanol, cyclopentanol, etanol cũng được sử dụng làm cơ chất. VSVSMT được chia thành 3 nhóm dựa trên nguồn cơ chất sử dụng để sinh methane.
VSVSMT sử dụng H2 (hydrogenotrophic methanogen)
Các lồi VSVSMT thuộc nhóm này sinh trưởng nhờ năng lượng tích lũy từ quá trình khử CO2 thành CH4, sử dụng H2 làm chất cho điện tử:
CO2 + 4H2 CH4 + 2H2O (ΔG0’ = 131 kJ/mol CH4)
Bên cạnh đó, format và một số rượu bậc thấp như ethanol, 2-propanol và 2-butanol cũng được sử dụng làm chất cho điện tử trong phản ứng khử CO2 thành CH4:
4HCOOH CH4 + 3CO2 + 2H2O (ΔG0’ = 135,6 kJ/mol CH4)
4CO + 2H2O CH4 + 3CO2 (ΔG0’ = 211 kJ/mol CH4)
2-Propanol + CO2 CH4 + 4 Aceton + 2H2O (ΔG0’ = 36,5 kJ/mol CH4) 2 Etanol + CO2 CH4 + 2 Acetate (ΔG0’ = 116,3 kJ/mol CH4)
VSVSMT sử dụng hydro thực hiện chức năng duy trì áp suất cục bộ của hydro trong hệ xử lý ở mức thấp phù hợp cho vi khuẩn sinh acetate (acetogenic bacteria) hoạt động, đảm bảo các axit béo và rượu được chuyển
thành acetate. Các chi thường gặp thuộc nhóm này gồm có
Methanobacterium, Methanobrevibacter, Methanococcus, Methanomicrobium, Methanogenium (Whitman et al., 2006).
VSVSMT sử dụng methanol (methylotrophic methanogen)
VSVSMT thuộc nhóm này có khả năng chuyển hóa các hợp chất cacbon bậc 1 có chứa nhóm methyl thành methane:
4CH3OH 3CH4 + CO2 + 2H2O (ΔG0’ = 106 kJ/mol CH4)
CH3OH + H2 CH4 + H2O (ΔG0’ = 112,5 kJ/mol CH4)
4 Methylamin + 2H2O 3CH4 + CO2 + 4NH4+ (ΔG0’ = 75 kJ/mol CH4) 2 Dimethylamin + 2H2O 3CH4 + CO2 + 2NH4+ (ΔG0’ = 73 kJ/mol CH4) 4 Trimethylamin + 6H2O 9CH4 + 3CO2 + 4NH4+ (ΔG0’ = 74 kJ/mol CH4) 2 Dimethylsulfid + 2H2O 3CH4 + CO2 + H2S (ΔG0’ = 74 kJ/mol CH4)
VSVSMT sử dụng methanol bao gồm phần lớn các loài của bộ
Methanosarcinales trừ chi Methanosaeta. Các loài thuộc chi Methanolobus có
thể sử dụng methyl sulfide; VSVSMT thuộc chi Methanosphaera chỉ sử dụng methanol khi có mặt CO2 như chất nhận điện tử.
VSVSMT sử dụng acetate (aceticlastic methanogen)
Phần lớn các lồi VSVSMT thuộc nhóm này chỉ sử dụng acetate làm cơ chất để sinh methane, giới hạn trong hai chi Methanosarcina và Methanosaeta (trước đây là Methanothrix). Các nhóm VSVSMT này đóng vai
trị chủ đạo trong các bể phân hủy kỵ khí chất thải hữu cơ tạo thành methane. Hai phần ba lượng khí methane được sinh ra trong các bể phân hủy kỵ khí chất thải hữu cơ nhờ hai chi Methanosarcina và Methanosaeta, chỉ có 1/3
lượng methane tạo thành nhờ các nhóm VSVSMT sử dụng H2 và CO2 (Mackie và Bryant, 1981).
CH3COOH CH4 + CO2 (ΔG0’= 37 kJ/mol CH4)
Thực tế các loài Methanosaeta được phân lập từ các bể phân hủy kỵ khí kỵ khí hoạt động ở cả mơi trường nước ngọt và nước mặn. Phân tích dựa trên trình tự gen 16S rRNA cho thấy Methanosaeta trong trầm tích biển khá phong phú, chiếm tỷ lệ từ 3,9 ÷ 11,8% tổng số Cổ khuẩn, tỷ lệ của Methanosaeta
càng cao khi càng xuống sâu trong trầm tích biển (Mori et al., 2012). Như vậy q trình sinh methane từ acetate diễn ra khá tích cực trong mơi trường nước biển, nơi quá trình khử sulfate được coi là chiếm ưu thế.
1.3.3.2. Sinh hóa của q trình phân hủy kỵ khí sinh methane
Q trình chuyển hóa sinh methane ở VSVSMT được mơ tả tại Hình 1.8 gồm 7 bước với sự tham gia của nhiều enzyme khác nhau.
Hình 1.8. Con đường hình thành methane từ acetate, methanol và CO2
(Rouvière và Wolfe, 1988)
Ở bước khởi đầu, các chất cho điện tử như H2 hoặc format chuyển điện tử cho CO2 (thông qua H2 hoặc format-dehydrogenase), tạo sản phẩm trung
gian formylmethanofuran (formyl-MFR). Tiếp theo là q trình chuyển nhóm formyl trong formyl-MFR thành nhóm methyl trong methyl-CoM qua 5 phản ứng sinh hóa.
Methyl-CoM là hợp chất trung gian giữ vị trí ngay trước methane trong chuỗi các phản ứng oxy hóa khử tạo methane, tham gia phản ứng với acetate để tạo thành methane nhờ enzyme methyl-CoM reductase. Như vậy con đường chuyển hóa H2, methanol, acetate và CO2 thành methane đều thông qua methyl-CoM, đây là hợp chất chìa khóa trung gian của q trình oxy hóa các cơ chất khác nhau thành CH4.
Methyl-coenzyme M reductase. Phản ứng cuối cùng sinh methane từ tất cả các cơ chất là phản ứng khử nhóm methyl của CH3-S-CoM thành CH4, được xúc tác bởi enzyme methyl-coenzyme M reductase (MR). Đây là một enzyme có mặt ở tất cả các VSVSMT, vì vậy được sử dụng làm phân tử chỉ thị để nghiên cứu đa dạng VSVSMT trong tự nhiên. Các gen mcrA, B, C, D, G tương ứng mã hóa cho các tiểu phần α, γ và β của enzyme methyl-coenzyme M reductase đã được xác định, trong đó đoạn gen mcrA có độ bảo thủ cao
thường được sử dụng làm phân tử chỉ thị cho VSVSMT trong nhiều nghiên cứu (Klein et al., 1988; Halles et al., 1996; Hallam et al., 2003) (Hình 1.9).
Hình 1.9. Sơ đồ mcr-operon ở Methanosarcina mazei (Halles et al., 1996; Hallam et al.,
2003). Cặp mồi mcrAf và mcrAr được thiết kế để nhân đoạn gen mcrA sử dụng trong nghiên cứu VSVSMT trong môi trường tự nhiên.
Các gen trong mcr- operon được sắp xếp theo thứ tự mcrBDCGA và
phiên mã ở dạng một bản sao. Hai gen mcrC và mcrD trực tiếp tổng hợp
polypeptid ở VSVSMT nhưng chức năng của chúng chưa được nghiên cứu đầy đủ (Allmansberger et al.,1989).
Nhiều cơng trình nghiên cứu đa dạng VSVSMT dựa trên trình tự gen
mcrA và 16S rDNA đã cho thấy sự tương đồng của các cây phân loại dựa trên
hai chỉ thị phân tử này (Luton et al., 2002; Zhu et al., 2011).
Coenzyme F420. F420 là coenzyme chứa nikel, đóng vai trị là chất cho điện tử,
liên kết với nhiều enzyme ở VSVSMT như hydrogenase, formate- dehydrogenase, CO-dehydrogenase (Whitman et al., 2006). F420 có mức oxy hóa khử trong khoảng 340 350 mV, phát ánh sáng xanh ở bước sóng 460 nm. Khả năng tự phát sáng của tế bào VSVSMT dưới tia huỳnh quang là do mức tích lũy cao của coenzyme F420 trong tế bào (Hình 1.10). Một số nghiên cứu cho thấy hàm lượng coenzyme F420 trong tế bào tỷ lệ với mức sinh trưởng và hoạt tính sinh học của VSVSMT (Heine-Dobbernnack et al., 1988).
Hình 1.10. Hình ảnh VSVSMT dưới kính hiển vi huỳnh quang. Tế bào phát sáng xanh nhờ
coenzyme F420 (JAMSTEC, 2011)
Do vậy, để đánh giá nhanh mật độ cũng như mức hoạt động của VSVSMT trong các hệ thống xử lý kỵ khí, việc quan sát mật độ và cường độ phát sáng của mẫu bùn kỵ khí dưới kính hiển vi huỳnh quang là một biện pháp nhanh và dễ dàng thực hiện.
1.3.3.3. Một số phương pháp nghiên cứu quần xã VSVSMT
Một trong những phương pháp nghiên cứu VSVSMT là kỹ thuật làm giàu và phân lập VSVSMT từ môi trường tự nhiên dựa trên các nguồn cơ chất thích hợp. Mơi trường làm giàu liên quan mật thiết với nguồn mẫu thu thập và điều kiện sinh thái của tập hợp các cá thể (môi trường nước ngọt hay nước mặn) (Kendall et al., 2006). Quy trình phân lập VSVSMT trong phịng thí nghiệm cũng tương đối phức tạp và còn nhiều hạn chế vì vậy khả năng phân lập đa dạng các chủng VSVSMT thuần khiết trong tự nhiên hết sức khó khăn (Whitman et al., 2006). Việc sử dụng tổ hợp VSVSMT có hoạt tính cao được làm giàu trong các điều kiện đặc biệt cho mục đích phân hủy chất thải hữu cơ là khá phổ biến (Xiao và Robert, 2010).
Do việc phân lập nuôi cấy không thuận lợi, đa dạng VSVSMT thường được nghiên cứu bằng các phương pháp không qua phân lập và nuôi cấy. Gorris và cộng sự (1988) đã đánh giá trực tiếp VSVSMT từ bùn lắng thông qua tín hiệu coenzyme F420 phát huỳnh quang, phương pháp này chỉ có thể xác định được khả năng chuyển hóa sinh methane và không thể cung cấp thông tin về thành phần VSVSMT có mặt trong tập hợp quần thể (Peck và Archer, 1989).
Nghiên cứu của Luton và cộng sự đã chỉ rõ sự đa dạng của quần thể VSVSMT dựa trên các chỉ thị phân tử (trình tự gen mcrA, 16S rDNA) trong
những điều kiện môi trường khác nhau (Luton et al., 2002). Sự đa dạng và cấu trúc của quần thể VSVSMT đã được xác định thông qua xác định gen mcrA (kích thước 530 bp) mã hóa cho tiểu phần α của methyl-coenzyme M reductase (Luton et al., 2002) hoặc 16S rDNA (Wanatabe et al., 2004) của quần thể VSVSMT bằng kỹ thuật thiết lập và phân tích thư viện gen hoặc kỹ thuật PCR - DGGE (Wanatabe et al., 2004)...
Đây là hai kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng phổ biến nhất trong các nghiên cứu về đa dạng VSVSMT trong môi trường sống tự nhiên, cũng như trong các hệ thống phân hủy kỵ khí. Trong những năm gần đây, một số kỹ thuật mới đã được áp dụng để nghiên cứu đa dạng VSVSMT cũng dựa trên các phân tử chỉ thị 16S rDNA và gen mcrA như RT-PCR (Mori et al., 2012) và pyrosequencing (Ellis et al., 2012). Các kỹ thuật này cho phép phân tích đồng thời một lượng lớn các trình tự gen chỉ thị thu nhận được từ mẫu mơi trường, theo đó đưa ra những thơng tin có độ chính xác cao hơn về bức tranh đa dạng chủng loài cũng như đa dạng các gen chức năng trong quần xã VSVSMT.
Khác biệt với những phương pháp sinh học phân tử kể trên, phương pháp FISH (Fluorescent In situ Hybridyzation) sử dụng các đầu dò gắn huỳnh quang nhằm phát hiện các tế bào cổ khuẩn một cách trực tiếp trong môi trường (Amann, 2000). Phương pháp này cho phép định lượng một cách tương đối chính xác số lượng tế bào vi sinh vật tương tác với đầu dò sử dụng, và phụ thuộc vào số các đầu dò khác nhau dùng trong nghiên cứu mà có được bức tranh đa dạng của VSVSMT trong mẫu được quan tâm (Netmann et al., 2010).
Gần đây, bên cạnh hai phân tử chỉ thị thường dùng cho VSVSMT là 16S rDNA và mcrA, một số phân tử chị thị mới được đưa vào sử dụng để nghiên cứu sâu hơn về đa dạng VSVSMT trong tự nhiên, cụ thể là mcrB, mcrG (gen mã hóa cho các tiểu phần β, γ của methyl-coenzyme M reductase) hay mtaB
(mã hóa cho methanol-5-hydroxybenzinmidazolylcobamide Co-
methyltransferase, xúc tác q trình chuyển hóa methanol thành methyl-CoM) và mtbA (mã hóa cho coenzyme M methyltransferase xúc tác quá trình
chuyển hóa mono-, di-, và trimethylamin thành methyl-CoM) (Dziewit et al., 2015). Nghiên cứu bước đầu cho thấy các phân tử chỉ thị mới này đáp ứng
được tính đặc hiệu cũng như thể hiện bức tranh đa dạng của VSVSMT một cách sâu sắc, đặc biệt đối với các VSVSMT sử dụng các hợp chất chứa nhóm methyl (Dziewit et al., 2015). Tuy nhiên, do mới được đưa vào sử dụng,
database của những phân tử chị thị này còn khiêm tốn so với các phân tử chỉ thị thông dụng là 16S rDNA và mcrA, đồng thời tính ổn định của chúng trong các kỹ thuật phân tử cũng cần được kiểm chứng để có thể trở thành các chỉ thị phân tử tin cậy dành cho VSVSMT trong tương lai..
1.3.3.4. VSVSMT trong môi trường nước lợ và nước biển
VSVSMT được tìm thấy trong các điều kiện môi trường khác nhau, từ nước ngọt cho tới nước lợ, nước biển và các mơi trường có nồng độ muối rất cao. Trong môi trường nước ngọt VSVSMT vẫn đòi hỏi nồng độ muối ở mức tối thiểu là 1 mM Na+ để sinh trưởng. VSVSMT trong môi trường nước lợ hoặc nước mặn, ion Na+ được sử dụng trong q trình tích lũy năng lượng của tế bào, tham gia xúc tác cho enzyme CoM –methyltransferase trên màng tế bào (Kaesler và Schonheit, 1989). Phần lớn VSVSMT chịu mặn cao đều thuộc chi Methanohalophilus, trong đó lồi Methanohalophilus mahii có khả
năng phát triển tốt với nồng độ muối tới 3 M. So sánh trình tự 16S và 23S rRNA cho thấy có mối liên hệ đặc biệt giữa VSVSMT ưa mặn
Methanomicrobiales và Cổ khuẩn ưa mặn cực đoan Halobacterium (Burggraf et al., 1991). Một số cơ chế thích nghi khác của VSVSMT với điều kiện mơi
trường có nồng độ muối thay đổi là nhờ lớp heteropolysaccharide (như ở loài
Methanosarcina thermophila) hay các túi methanocondroitin đệm dày bao
quanh tế bào (như ở một số loài Methanosarcina ưa nhiệt), tích lũy β-
glutamate trong nguyên sinh chất (như ở loài Methanococcus
thermolithotrophicus) để bảo vệ tế bào khỏi ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu
Đa số loài methanogens chịu mặn, sinh trưởng với nồng độ muối bão hòa được xác định thuộc bộ Methanosarcinales, họ Methanosarcinaceae
(Boon et al, 2001; de la Haba et al, 2011). Đến năm 2011, họ này được phát
hiện có 9 chi gồm 30 lồi. Các chi có khả năng sinh trưởng trong điều kiện ưa mặn phải kể đến gồm Methanohalobium, Methanohalophilus, Methanosalsum và Methanocalculus (Ollivier et al., 1998; Boon et al., 2001). Trong đó lồi
Methanocalculus halotolerans tìm thấy trong giếng dầu ở Alsace thuộc nước
Pháp. Lồi này có thể sinh trưởng tối ưu tại 50 g L-1 NaCl và sử dụng H2 , CO2 và format để sinh methane (Ollivier et al., 1998).
Trong môi trường nước biển, sulfate tồn tại ở nồng độ 28 mM, là chất nhận điện tử quan trọng thứ hai sau oxy. Ở điều kiện này vi khuẩn khử sulfate có điều kiện phát triển thuận lợi, do vậy chiếm ưu thế và cạnh tranh với VSVSMT về các nguồn cơ chất, đặc biệt là acetate và H2 (Rabus et al., 2006). Do có ái lực với acetate cao (Ks = 9,5 mg/L) hơn VSVSMT (Ks = 32,8 mg/L), vi khuẩn khử sulfate có thể ức chế được VSVSMT ở điều kiện nồng độ acetate thấp (Oremland, 1988), dẫn đến khử sulfate trở thành bước oxy hóa chất hữu cơ cuối cùng trong hệ xử lý kỵ khí thay cho sinh methane (McFarland và Jewell, 1990). Vi khuẩn khử sulfate và VSVSMT có mức cạnh tranh cao khi tỷ lệ COD/SO4 ở trong khoảng 1,7 – 2,7. Khi tỷ lệ này tăng, ưu thế sẽ thuộc về VSVSMT và ngược lại, khi tỷ lện này giảm ưu thế sẽ thuộc về vi khuẩn khử sulfate (Choi & Rim, 1991).
Bên cạnh đó, sulfide tạo ra trong quá trình khử sulfate là chất độc đối với tế bào, có tác dụng ức chế nhiều sinh vật, trong đó có VSVSMT. Như vậy, q trình phân hủy kỵ khí sinh methane khi hoạt động ở điều kiện nước lợ và nước biển sẽ chịu ảnh hưởng lớn từ vi khuẩn khử sulfate.
Trong thực tế vận hành các hệ thống phân hủy kỵ khí sinh methane, một số hợp chất oxyanion nhóm VI như MoO42-, CrO42-, WO42-, SeO42- được sử dụng để ức chế hoạt động của vi khuẩn khử sulfate (do chúng có cấu trúc tương tự như SO42-) theo cơ chế cạnh tranh (Oremland và Cappon, 1988; Schulz và Zabel, 2006). Molybdate ức chế một cách chọn lọc bước kích hoạt sulfate ở dạng APS (adenosine - 5’- phosphosunfate) khởi đầu của quá trình khử sulfate thông qua phản ứng kết hợp với ATP, làm giảm lượng ATP trong tế bào (Hình 1.11).
Hình 1.11. Cơ chế tác động của các chất ức chế oxyanion nhóm VI tới q trình khử
sulfate ở vi khuẩn khử sulfate (vị trí mũi tên đậm) (Schulz và Zabel, 2006)
Nghiên cứu thực hiện trong phịng thí nghiệm với các chủng vi khuẩn khử sulfate cho thấy ở nồng độ 2 mM, MoO42- đã có thể ức chế tới 80% quá trình khử sulfate (Rabus et al., 2006). Khi bổ sung Na2MoO42- vào trầm tích biển tới nồng độ 20 mM (tương đương với nồng độ của sulfate trong mơi trường biển) thì q trình khử sulfate bị ức chế hồn tồn (Schulz và Zabel, 2006). Na2MoO4 là chất không độc đối với tế bào, do vậy thường được dùng cho mục đích kiểm sốt q trình tạo sulfide sinh học do vi khuẩn khử sulfate. Ngoài ra việc ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn khử sulfate trong mơi
trường nước mặn cịn giúp giảm thiểu sự cạnh tranh với VSVSMT về các nguồn cơ chất.