7 10 18a 20a 21 23a 23b 24 25a 25b
3.5.2. Tạo giống khởi động VSVSMT
Để nuôi tăng sinh VSVSMT từ mẫu làm giàu NTLRE3 và M37, cám gạo được lựa chọn làm cơ chất do có các thành phần protein, lipid, glucid cùng nhiều chất khoáng, nguyên tố vi lượng, vitamin… Đây là nguồn cơ chất có giá thành thấp và thích hợp cho sự tăng sinh của các nhóm lên men sinh axit cũng như nhóm phân hủy kỵ khí tạo methane. Khi sử dụng cám gạo để nuôi tăng sinh, nguồn cơ chất cho VSVSMT trong mẫu làm giàu NTLRE3 và chủng M37 sẽ là hỗn hợp các sản phẩm của quá trình phân hủy kỵ khí cám gạo, bao gồm cả hydro, CO2, các axít béo bay hơi và rượu bậc thấp.
Trước khi đưa vào môi trường nuôi tăng sinh VSVSMT, cám gạo được xử lý qua quá trình lên men trong hỗn hợp 10% với mơi trường khống dịch thể có hàm lượng muối 17 g/L ở điều kiện kỵ khí. Q trình lên men sinh axit này được thực hiện nhờ các loài vi sinh vật có mặt trong mẫu làm giàu NTLRE3 bên cạnh các VSVSMT. Mẫu làm giàu NTLRE3 được cấy vào bình lên men cám gạo theo tỷ lệ 10% thể tích để khởi động. Q trình lên men sinh axit được thực hiện trong thời gian 10 ngày khi pH đạt tới mức 4,0 thì dừng lại và dịch lên men được bảo quản tại 4C như nguồn cơ chất ni VSVSMT. Dịch lên men sau đó được bổ sung vào mơi trường ni VSVSMT theo tỷ lệ 1:20 (v:v) làm cơ chất để sinh trưởng.
Nhân giống VSVSMT cấp I được thực hiện trong các bình Scott thể tích 500 ml chứa 400 ml mơi trường khống nước lợ hoặc nước biển nhân tạo (Widdel và Bak, 1992), bổ sung 25 ml dịch lên men cám gạo 10%, 50 ml dịch mẫu làm giàu NTLRE3 và 50 ml dịch nuôi M37. Sự phát triển của VSVSMT trong bình nhân giống cấp I được đánh giá thơng qua mức độ và tính ổn định của việc tạo thành methane (Hình 3.14).
Có thể thấy thành phần methane trong khí sinh ra tăng đều ngay sau khi bắt đầu nuôi, đạt 32% sau 8 ngày và giữ mức ổn định ở những ngày tiếp theo (đạt 33% ở ngày thứ 10). Khơng có sự khác biệt đáng kể giữa việc sinh trưởng trong môi trường nước lợ và nước mặn. Do vậy, để tạo nguồn VSVSMT cho các thí nghiệm mơ hình phân hủy kỵ khí kỵ khí mơi trường nước biển nhân tạo với hàm lượng muối là 26,4 g/L được lựa chọn.
Hình 3.14. Tỷ lệ methane được sinh ra bởi VSVSMT trong mơi trường khống bổ sung
cám gạo lên men trong điều kiện nước lợ và nước mặn. Thí nghiệm lặp lại 2 lần và giá trị biểu diễn trên đồ thị là giá trị trung bình
Ở thể tích lớn hơn, nguồn VSVSMT được nuôi trong bình Scott 2 lít chứa 1,5 lít mơi trường nước biển nhân tạo (Rabus et al., 2006), 100 ml cám gạo phân hủy kỵ khí, 200 ml dịch nuôi cấp I, nuôi tại 37C trong thời gian 15 ngày (Hình 3.15A). Thí nghiệm ni dừng ở thời điểm mức methane trong
Thời gian (ngày)
T ỷ lệ CH 4 s ỉnh ra (%)
khí tạo ra đạt >30%. Để cân bằng áp suất, khí sinh ra được thốt ra ngoài bằng van kim đặt tại nắp của bình ni. Nguồn VSVSMT sau đó được kiểm tra dưới kính hiển vi huỳnh quang để quan sát mức độ phát sáng của coenzyme F420 (Hình 3.15B).
Hoạt tính sinh methane được xác định đối với 1 ml dịch nuôi trong môi trường khống nước biển có bổ sung acetate (20 mM) làm cơ chất và hoạt tính được tính theo lượng methane sinh ra trong 1 ngày. Theo đó, hoạt tính của VSVSMT trong bình nhân giống 350 mol/ml/ngày, tương đương với bùn trong bể kỵ khí đang hoạt động tốt ở điều kiện nước ngọt (theo kết quả nghiên cứu phân tích mẫu bùn của các hệ thống phân hủy kỵ khí UASB và AF trước đây).
Hình 3.15. Bình ni giống khởi động VSVSMT từ mẫu làm giàu NTLRE3 và chủng M37
với cám gạo lên men trong môi trường nước biển sau 15 ngày (A) và mức độ phát sáng dưới kính hiển vi huỳnh quang (B)
Bên cạnh đó, số lượng VSVSMT trong mẫu dịch nuôi được xác định bằng phương pháp MPN sử dụng mơi trường dịch thể kỵ khí với Na-acetate làm nguồn cơ chất. Sinh trưởng của VSVSMT trong các ống MPN được xác định thông qua sự có mặt của methane trong ống. Kết quả phân tích cho số lượng VSVSMT trong mẫu dịch nuôi là 1,1 109 MPN/ml. Tuy nhiên, VSVSMT nuôi theo phương pháp này sẽ tồn tại phần lớn ở dạng hạt bùn, do vậy kết quả đếm MPN thường thấp hơn so với số lượng thực tế.
Như vậy sử dụng mơi trường khống nước biển nhân tạo và cám gạo lên men làm cơ chất cho quá trình phân hủy kỵ khí, nguồn VSVSMT có hoạt tính tốt và ổn định đã được nhân thành công từ mẫu làm giàu NTLRE3 và chủng
Methanosarcina sp. M37. Để tiện theo dõi, ký hiệu BKM được đặt cho nguồn
VSVSMT này trong các phần nghiên cứu tiếp sau.